高效液相色譜串聯三重四極桿質譜法同時檢測鮮乳中5種黃曲霉毒素

譚 煒，張 雷，張咪咪，安 虹

1.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽合肥 230051；2.國家農副加工食品監督檢驗中心，安徽合肥 230051

真菌毒素是真菌在生長繁殖過程中產生的一系列次級代謝產物，目前在自然界中已發現的真菌毒素有400多種[1]。其中大部分真菌毒素具有致畸、致癌、致突變、肝腎毒性、免疫毒性和神經毒性等危害，嚴重危害人類健康[2]。嘔吐毒素（DON）、黃曲霉毒素M1（AFT-M1）、黃曲霉毒素B1（AFT-B1）、赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮(ZON)等，在食品領域報道較為常見[2-5]。目前，國內外對真菌毒素的檢測多采用薄層法、酶聯免疫法、氣質聯用法、液相法、液質聯用法等[6]。然而，薄層法雖然快捷，但是重復性差、精度不高；酶聯免疫法特異性強，但假陽性率高；氣質聯用法前處理繁瑣；液相法穩定、靈敏，但無法同時分析檢測同系物或異構體。液質聯用法，選擇性好、靈敏度高、適用性強且能多組分同時檢測。已被廣泛應用于真菌毒素檢測，成為食品檢測領域的研究熱點[7]。

鮮奶中的真菌毒素源自奶牛的飼料，污染飼料的真菌種類繁多，導致牛奶中往往有多種真菌毒素同時存在[8]。本研究旨在建立一種液相色譜串聯三重四極桿質譜法同時檢測牛奶中5種黃曲霉毒素的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器

超高效液相色譜儀LC-30A串聯三重四極桿質譜儀LCMS-8050，日本島津公司；Reax top渦旋混合器，德國Heidolph集團；KDC-160HR高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；N-EVAP-34型氮吹儀，美國Organomation公司；PURELAB flex 3超純水機，法國威立雅公司；S300H超聲波清洗器，德國Elma公司。

1.2 分析條件

液相色譜條件：LC-30A系統；Waters ACQUITY BEH C18（1.7 μm，100 mm×2.1 mm)；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇；流速：0.3 mL/min；進樣體積：10 μL；柱溫40℃；洗脫方式：梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫時間程序

質譜條件：分析儀器：LCMS-8050，離子源：ESI，正離子掃描，離子源接口電壓：4.5 kV，霧化氣：氮氣3.0 L/min，干燥氣：氮氣15 L/min，碰撞氣：氬氣，脫溶劑管溫度：250℃， 加熱模塊溫度：400℃，掃描模式：多反應監測(MRM)，駐留時間：30 ms，延遲時間：3 ms。MRM參數見表2。

表2 MRM參數

1.3 樣品制備標準溶液配制

取適量單標儲備液，用乙腈配制成10 mg/L的混合標準溶液，用水逐級稀釋成濃度為20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、2 ng/mL、1 ng/mL的標準工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取取5 g(精密稱定至0.01 g)樣品于20 mL乙腈/水(85/15，v/v)中渦旋2 min，超聲45 min，8 000 r/min離心10 min后，取上清液2 mL于25 mL容量瓶，用1%吐溫-20 PBS稀釋并定容后,取上清液于50 mL量瓶中,以乙腈/水(70/30，v/v)稀釋定容至50 mL，備用。

1.4.2 凈化將提取的液體過免疫親和柱，用10 mL PBS淋洗柱子，吹干，再用5 mL的甲醇洗脫，吹干，收集洗脫液，并用氮氣吹干，用1.0 mL乙腈/水(20/80，v/v)溶液溶解殘留物，過0.22 pm濾膜并收集濾液，進行LCMS/MS分析。

2 結果與分析

2.1 標準樣品的MRM色譜圖

10 ng/mL混合標準樣品的MRM色譜見圖1。

圖1 混合標準樣品的MRM色譜圖

2.2 線性關系、檢出限及定量限考察

將 濃 度 為1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的 混 合標準工作液，按分析條件進行測定，以濃度比為橫坐標，以峰面積比為縱坐標，外標法制作校準曲線；通過在不含真菌毒素的鮮奶基質中加入相應量的真菌毒素混合標準品，配制基質匹配的系列標準溶液(1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L）， 按分析條件進行測定，以濃度比為橫坐標，峰面積比為縱坐標進行線性回歸分析。方法的回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限、定量限見表3。

表3 線性關系、檢出限及定量限

2.3 回收率和精密度實驗

對1 ng/mL、5 ng/mL和10 ng/mL混合標準溶液連續進行6次進樣，3個濃度標準品的回收率范圍在81.0%~115.8%，表明該方法準確、可靠；相對標準偏差為1.5%~8.8%之間，表明方法精密度良好。

2.4 實際樣品測定

取25批鮮奶樣品，按照分析條件和樣品前處理方法同時檢測其中的5種真菌毒素含量，在25批樣品中共有3組檢出AFT-M1，含量分別為0.18 μg/kg、0.21 μg/kg、0.25 μg/kg，其 他毒素含量均低于檢出限。表明該方法快捷、有效，適用于鮮乳中5種真菌毒素的高效檢測。

3 結束語

本研究建立了一種超高效液相色譜串聯三重四極桿質譜儀的方法能同時高效測定鮮乳中5種常見的真菌毒素。5種毒素在1~20 ng/mL濃度范圍內線性良好；低、中、高3個濃度加標回收率和相對標準偏差分別在81.0%~115.8%和1.5%~8.8%之 間，具有較高的準確性和精確度，且無需內標，前處理操作簡單、快捷。

表4 3個濃度水平的加標回收率和精密度實驗(n=6)

表5 實際樣品測定結果