菊花揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌抑制作用的研究

韓曉芳，郭彪輝，李麗雪，鎮(zhèn)鴻燕，陳 璇

(1.江漢大學(xué) 環(huán)境與健康學(xué)院, 湖北 武漢 430056；2.江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 湖北 武漢 430056；3.武漢市城市防洪勘測設(shè)計院有限公司，湖北 武漢 430014)

1 引言

本研究所用菊花產(chǎn)自湖北省，具有獨特的殺菌、消炎、解毒等作用，可有效減輕煙氣對肺部所產(chǎn)生的炎性反應(yīng)和氧化損傷，暫未發(fā)現(xiàn)毒害作用。近年來有關(guān)菊花揮發(fā)性成分分析的文獻(xiàn)較多，但對于菊花揮發(fā)油主要成分分析及其抗細(xì)菌功效的研究鮮有報道[1～5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，揮發(fā)油、氨基酸類物質(zhì)、黃酮類化合物，以及其他微量元素是菊花的主要組成成分，使其在藥理學(xué)中應(yīng)用廣泛，有抵抗細(xì)菌、對抗病菌毒素、清熱解毒功效[6]。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，也是醫(yī)療感染和食品中最常見的病原體之一，由其引起的食物中毒已成為世界性的公共衛(wèi)生問題。鑒于菊花成分有效的抑菌作用[7，8]，本研究采用水蒸氣蒸餾法提取香菊精油，主要成分為萜烯類、醇類、醛酮類等揮發(fā)性成分，探究其對金黃色葡萄球菌的抑菌效果及影響因素，以期為金黃色葡萄球菌的防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

菊花(產(chǎn)自湖北省武漢市)；金黃色葡萄球菌(江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院)；甲苯胺藍(lán)核酸瓊脂培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；Tween-80試劑。

2.2 實驗儀器

BD240 型 36℃ 微生物培養(yǎng)箱、KB240 型 28℃ 生化培養(yǎng)箱、AC2-4S1 型生物安全柜(均購自德國Binder)；Sup G6R 型菌落計數(shù)/篩選/抑菌圈測量聯(lián)用儀(新加坡Esco)；雷磁pH計(PHS-3C)：BOXUN 超凈工作臺(SW-CJ-1F)；分光光度計(721G 可見分光光度計)；快速恒溫數(shù)顯水箱(HH-42)；氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司 6890GC/5973MSD型)

2.3 研究方法

2.3.1 香菊精油的制備

取15種不同批次的菊花藥材，每種批次50 g，加400 mL蒸餾水浸泡3 h,后根據(jù)《中國藥典》(2010),采用水蒸氣蒸餾法提取菊花揮發(fā)油[9，10]，將原料放入蒸餾鍋，加水浸過料層，加熱，連續(xù)提取5 h,得到油狀物質(zhì),冷卻放置，密封，儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 提取物抑菌效果的研究

2.3.2.1 試管稀釋法測最低抑菌濃度(MIC)

采用二倍稀釋法確定最低抑菌濃度。以1∶1體積比向待測樣品中加入5‰Tween-80溶液，將稀釋好的待測樣取出一半倒入新試管，再加入同等體積的5‰Tween-80溶液稀釋，依次類推，將原液濃度稀釋為原來的1/2，1/4，1/8，1/16等。采用牛津小杯法進(jìn)行抑菌實驗，用同體積的Tween-80溶液作空白對照[11]，24 h后觀察。

2.3.2.2 pH值對菊花揮發(fā)油抑菌效果影響

制備菌懸液(20環(huán)菌種+2 mL鹽水)，在最低抑菌濃度(MIC)中培養(yǎng)24 h，測定抑菌活性。

配制普通牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，分成5份，調(diào)節(jié)pH值分別為5、6、7、8、9，用高壓滅菌鍋滅菌20 min，不同pH值的液體培養(yǎng)基分別設(shè)置完全空白組，金黃色葡萄球菌組，揮發(fā)油組，以及金黃色葡萄球菌和揮發(fā)油混合組。培養(yǎng)24 h后通過檢測試管中培養(yǎng)液的吸光度反映抑菌率。

2.3.2.3 對金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶的抑制實驗

在甲苯胺藍(lán)核酸瓊脂上打出10～12個直徑約3 mm的小孔(超凈工作臺中操作)，取10 μL在最低抑菌濃度揮發(fā)油條件下培養(yǎng)24 h的菌懸液，接種到小孔中，35 ℃下培養(yǎng)4 h，觀察實驗結(jié)果[12～14]。

2.3.2.4 揮發(fā)油成分分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對菊花揮發(fā)油進(jìn)行指紋圖譜測定[15]，采取國家藥監(jiān)局推廣建議的中藥指紋圖譜軟件來計算，生成菊花揮發(fā)油的指紋圖譜。

3 結(jié)果與分析

3.1 最低抑菌濃度(MIC)的確定

3.1.1 最低抑菌濃度的初步確定

由圖1可知，經(jīng)24 h培養(yǎng)后，4個濃度均有抑菌圈出現(xiàn)，且大小相近，應(yīng)繼續(xù)用二倍稀釋法對原揮發(fā)油溶液進(jìn)行稀釋，尋找最低抑菌濃度。

(a)實驗組 (b)對照組

3.1.2 最低抑菌濃度的最終確定

采用二倍稀釋法將揮發(fā)油原液繼續(xù)稀釋到原液濃度的1/8、1/64、1/128、1/256，并設(shè)置原液作為陽性對照組，同體積Tween-80水溶液作為陰性對照組(KB組)，相同條件下進(jìn)行抑菌實驗。測量各組抑菌圈生長直徑，結(jié)果見表1。

表1 二倍稀釋法測最低抑菌濃度中不同濃度揮發(fā)油抑菌圈直徑

實驗中KB組沒有抑菌圈出現(xiàn)，因此牛津杯直徑為7.5 mm,1/256～1/8原液濃度范圍內(nèi)，隨著揮發(fā)油濃度的減小，抑菌圈直徑也逐漸減小，當(dāng)濃度為原液濃度的1/256時，抑菌圈大小與KB組極為接近，即該濃度為最低抑菌濃度。

3.2 pH值對菊花揮發(fā)油抑菌效果影響

本研究采用菌液吸光度反映不同pH值下的抑菌率。相同條件下，吸光度越高，菌液內(nèi)細(xì)菌數(shù)量越多，即抑菌效果越差；反之，抑菌效果越好。繪制pH值-吸光度曲線如圖2所示。

圖2 pH度對吸光度的影響

由圖2可知，pH值與菌液吸光度的相關(guān)性顯著，呈拋物線關(guān)系，隨著pH值的上升，吸光度先上升后下降，在pH=8附近達(dá)到峰值?？蓳?jù)此推斷，pH值對揮發(fā)油抑菌效果有顯著影響。pH=8時抑菌效果最差，pH=5時抑菌效果最好。

3.3 菊花揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶的抑制實驗

由圖3可知，在對金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶的抑制實驗中，發(fā)現(xiàn)無粉紅色暈和藍(lán)色圈圍繞產(chǎn)生，TNase反應(yīng)結(jié)果呈陰性，表明高濃度菊花揮發(fā)油能有效抑制金黃色葡萄球菌的產(chǎn)毒素作用。

圖3 金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶的抑制實驗

3.4 揮發(fā)油成分分析

3.4.1 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)圖譜建立

上機GC/MS條件：HP-5MS(30 m×250μm×0.25 μm)毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣及流速：He ，1 mL/min；柱頭壓：7.6522 psi ；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：10∶1；程序升溫：40 ℃ (3 min)以5 ℃/min升到150 ℃，再以8 ℃/min升到250 ℃ (5 min)；溶劑延遲：4 min；傳輸線溫度：280 ℃；EI源電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；質(zhì)譜掃描范圍：30～400 amu；應(yīng)用NIST08譜庫進(jìn)行檢索[16]。結(jié)果如圖4所示。

圖4 菊花揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜共有模式

所有組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計算機處理和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫檢索鑒定后,可初步確定菊花揮發(fā)性成分中的化合物，計算菊花揮發(fā)油的指紋圖譜，總共形成114個峰，選取其中分離的最好并且最為平穩(wěn)的84號峰(三甲基-2-vinylbicyclo1，7,HEPT-)作為參照，其余42個峰的相對保留時間可以由此得出[17]。這43個峰的面積總和占總峰面積的絕大部分，大于70%。

3.4.2 菊花揮發(fā)油質(zhì)譜分析結(jié)果

搜索標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜圖庫NIST08，同時整合大量數(shù)據(jù)，辨析了菊花揮發(fā)油指紋圖譜中的共有峰成分，求出每個峰的相對保留值，結(jié)果見表2。

表2 菊花揮發(fā)油指紋圖譜中的共有峰成分分析

續(xù)表2

神農(nóng)香菊揮發(fā)油圖譜的成分分析顯示，菊花揮發(fā)油中主要有43種化合物，其中苯類、烴類、烯類以及醇類物質(zhì)占大部分，還包含酸類和烯類氧化物。推測揮發(fā)油中起抑菌作用的物質(zhì)可能是其中的萜烯類、醇類、醛酮類等揮發(fā)性成分，但是也無法確定具體的物質(zhì)[18]。

4 結(jié)論

菊花揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用，是比較理想的金黃色葡萄球菌抑制劑。通過二倍稀釋法得出：最低抑菌濃度為揮發(fā)油原液濃度的1/256；通過pH值對菊花揮發(fā)油抑菌效果的影響實驗得出：pH值值與揮發(fā)油抑菌效果有較為顯著的曲線關(guān)系，pH=8時，抑菌效果最差，pH=5時，抑菌效果最好；耐熱核酸酶抑制試驗的結(jié)果表明：揮發(fā)油能有效抑制金黃色葡萄球菌的產(chǎn)毒作用。此外，本研究利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對菊花揮發(fā)油主要成分進(jìn)行分析，推測起抑菌作用的可能是其中的萜烯類、醇類、醛酮類等物質(zhì)，但確定菊花揮發(fā)油中抑菌物質(zhì)的具體成分，還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。