一株稻田固氮藍藻的分離鑒定及其鎘耐受和去除能力評估

張定煌，朱 嫡，李擁軍，蘇增強，李 杰，賀鴻志*

(1.中山市農產品質量安全檢驗所，廣東中山 528400；2.華南農業大學資源環境學院，廣東廣州 510000；3.清遠職業技術學院，廣東清遠 511500)

鎘(Cd)污染治理是當前國家的重大需求，國內外研究表明微藻可能在Cd污染水體處理方面具有很大潛力。固氮藍藻是熱帶亞熱帶地區重要的微生物資源，自從1889年Franck發現了固氮藍藻，到20世紀末期已得出20多個屬的150多種藍藻具有固氮能力。我國記載了800多種藍藻，其中有固氮能力的就有70多種。且我國很早就有將固氮藻類中的葛仙米和發菜等作為食品和藥物使用的記載，已經成了價格高昂的保健食品。研究表明稻田中接種固氮藍藻可顯著增產，如在湖北晚稻田中測得其固氮量為22.5～37.5 kg/hm。隨全球變暖和水體富營養化日益嚴重，固氮藍藻的農業應用和生態價值將日益凸顯。同時，研究表明固氮藍藻在生物活性物質發掘、新能源開發、功能食品研制和環境保護等方面均具有重要的應用前景。固氮藍藻蛋白質含量高，氨基酸組成完全，含有豐富的維生素和微量元素，在生長繁殖過程中還可分泌出少量的氨基酸、激素等活性物質促進作物生長。固氮藍藻還可以用于環境污染修復，并已有利用藻菌結合體清除石油污染的報道。一些固氮藍藻可以用于水體營養物質和重金屬的去除。同時，固氮藍藻還具有修復水體農藥和染料等污染的潛力。已有很多利用篩選到的固氮藍藻結合固定化技術進行了應用技術方面的探索。另外，在我國西北地區絲狀固氮藍藻已被用于荒漠和鹽堿化土壤治理中，并獲得了不錯的效果。

國內已有對湖北、湖南、江西、北京、延邊、西北荒漠區等地的固氮藍藻資源的調查研究，并分離純化了不少固氮藻株，但關于廣東、廣西、海南等省份固氮藍藻的研究非常少。現在中國科學院武漢水生生物研究所藻種庫保存的藻種主要來自湖北、湖南和江西等亞熱帶地區，可以預見屬熱帶、亞熱帶的海南、廣東、廣西部分地區必定有不少的固氮藍藻種質資源待發掘，甚至可能會有某些特殊功能的種類存在。筆者從中山實驗田采集土樣、水樣，然后經過紫外線法、抗生素法將其純化為單一藻株，鑒定出藻種為念珠藻，通過重金屬Cd對念珠藻的急性試驗，評估Cd對念珠藻的生態毒理效應，研究其對鎘的耐受能力和去除能力。

1 材料與方法

試驗所用固氮藍藻培養基為無氮BG11(BG11)。除培養基以外，所用的藥品還包括乙醇、(1+1)鹽酸溶液、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸氫二鈉、硼砂、氯化鉀、pH=4.01 標準緩沖溶液、pH=6.87 標準緩沖溶液、pH=9.18標準緩沖溶液、20 mg/L的鎘溶液。

100 mL錐形瓶、50 mL錐形瓶、分光光度計、TOC 分析儀、往復式振蕩器、磁力攪拌儀、光照培養箱、微孔濾膜、離心管、試管、燒杯、滴管、移液槍(20 μL、200 μL、1 000 μL、5 mL)、電子天平、4 ℃冰箱、-40 ℃冰箱、比色皿、各種規格培養皿、酒精燈、接種環、高壓滅菌鍋、帶相機和視頻攝像頭的Olympus倒置顯微鏡、低溫高速離心機、凍干機、超凈工作臺、抽濾裝置、純水機、酸度計。

藻的富集培養。將從中山實驗田采集回來的土樣、水樣取少量放入100 mL錐形瓶中，分別加入40 mL無氮BG11培養基放在恒溫培養箱中進行富集培養，培養條件為溫度(27±1)℃、光照(2 700±50)lx、光暗比16 h∶8 h。

藻株分離。培養20 d后，將富集培養的藻樣用移液器移取20～50 μL涂布于含BG11的瓊脂固體平板上。等長出肉眼可見的藻后，用接種環小心挑取，在新的固體培養基上Z字形劃線轉接，重復此操作直到純化出單一藻種為止。分離方法：在超凈工作臺內，將接種環在酒精燈上灼燒，接種環除菌后蘸取少許待純化藻類，在無菌BG11固體培養基表面進行平行劃線、扇形劃線或Z字劃線的連續劃線，用無菌的Parafilm對培養皿進行封口，放在培養箱中倒置培養，用以分離出單個菌落。待長出單個菌落后，在顯微鏡下觀察藻的形態、細胞結構，看是否為單一藻株，若不是單一藻株，再采用相同的方法或者毛細管分離法、梯度稀釋法進行分離，直至找到單一藻株。

藻種純化。用抗生素、抗菌酮等處理，除菌、純化藻株，具體步驟為先分別在5個50 mL 錐形瓶中加入BG11培養液 20 mL，經過高壓蒸汽滅菌后，冷卻，在超凈工作臺接種2 mL藻株在50 mL錐形瓶中；同時配制氨芐青霉素、硫酸慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素4 種抗生素的混合濃縮液共10 mL，濃度均為 2 g/L，在超凈工作臺中用無菌的一次性過濾頭和針筒過濾混合液，裝在預先滅菌的玻璃錐形瓶中；然后分別取2 g/L的混合抗生素母液10、8、6、4、2 μL加至上述含BG11培養液20 mL的5個50 mL錐形瓶中，處理 3 d。3 d后離心機15 ℃、7 000 r/min離心7 min，棄去上清液，隨后沉淀用無菌水離心清洗3 次，劃平板，用封口膜封口，放入培養箱中培養。重復上述操作直至通過顯微鏡觀察不到明顯的菌生長。藻株的保存采用固體培養基斜面或平板保種(常溫或低溫)和液體培養基保種相結合的方法。

藻株的擴大培養。在1個 50 mL錐形瓶中加入BG11培養液20 mL，經過高壓蒸汽滅菌后，冷卻，在超凈工作臺中用接種環從分離純化后的固氮藍藻培養皿中刮取少量藻株接種到上述錐形瓶中，確保要刮取到藻，然后放培養箱中培養，每天定時搖瓶4～6 次。

采用分子生物學方法對藍藻進行鑒定，通過選擇有代表性的基因序列片段作為分類標準來區分不同生物、同種生物種內株系之間的遺傳差異，此方法操作容易、結果可靠。

將篩選出來的優良藻株用16S rDNA序列分析法進行鑒定，即用一對引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和 1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)進行PCR擴增，通過測序確定16S rDNA序列，再通過 Genebank 進行 Blast 比較分析確定藻株所屬的屬。在此基礎上，用兩對引物CX(5′-GGCGCAGGTAAGAAAGGGTTTCGTA-3′)、CW(5′-CGTAGCTTCCGGTGGTATCCAC GT-3′)對固氮藍藻基因進行擴增和測序。通過 Blast比較分析進行藻種鑒定。

取8個50 mL錐形瓶，每個瓶中裝20 mL的BG11培養基。向錐形瓶中加入不同體積Cd母液(20 mg/L)，使瓶中Cd最終濃度分別為0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600和0.800 mg/L。每個瓶中再加入2 mL培養到對數生長期的藻種液。培養4 d后在超凈工作臺取3 mL均勻藻液測OD值，并觀察藻細胞的變化。

取100 mL錐形瓶，每個瓶裝40 mL的BG11培養基。向錐形瓶中加入不同體積Cd母液(20 mg/L)，使Cd最終濃度分別為0.1和0.2 mg/L。每個瓶中再加入2 mL培養到對數生長期的藻種液。放入培養箱中培養，分別在24和48 h后取樣抽濾，然后用原子吸收法進行Cd濃度的測定。

取正常生長和0.2 mg/L Cd處理4 d后的藻液高速離心收集藻細胞，用凍干機進行凍干。干燥后的樣品用傅立葉變換紅外光譜儀(Thermo Scientific Nicolet IS50，美國)進行紅外光譜分析。

采用溴化鉀壓片法，取干藻樣1.5 mg與0.3 g干燥的KBr粉末一起研細，研磨充分后，將樣品壓成薄片后進行測定。

試驗結果用 Excel 軟件(2013 版)進行處理，再利用 SPSS 22.0 中的多因素方差分析(ANOVA)對測定項目的試驗結果進行方差分析，Duncan’s 檢驗(<0.05)比較各處理間差異的顯著性。

2 結果與分析

無氮 BG11 培養基預培養富集后，綜合采用多種分離方法，獲得固氮藍藻的單種培養，最后經多種抗生素聯合處理得到無菌藻株。純化后藻絲形態見圖1，由圖1可知，在10×100倍鏡下，藻絲長，藻細胞飽滿，具異形胞，異形胞間生，從形態看屬于念珠藻目藻株(該試驗命名為藻D)。

圖1 分離得到的一株具有異形胞的念珠藻Fig.1 A strain of nostoc with heterocysts isolated

對藻細胞16S rDNA和基因序列進行分析，通過Genebank進行Blast比較分析確定藻株所屬的屬。Blast比對結果見表1。根據16S rDNA序列Blast結果，藻D屬于念珠藻屬。而基因序列Blast結果表明藻D與sp.NIES-2111親源關系最近，同源性達到97%。

表1 藻株的16S rDNA序列和rbcLX基因序列的Blast比對結果

對藻形態的影響。不同Cd濃度條件下生長的藻D的細胞形態如圖2所示。由圖2可知，在Cd濃度為0.200 mg/L時，藻絲開始斷裂，并出現扭曲，在Cd濃度為0.600 mg/L時，念珠藻細胞被破壞的更加嚴重，且顏色變淡。

圖2 不同Cd濃度下生長的藻D在顯微鏡下的微觀形態Fig.2 Microscopic morphology of algae D grown under different Cd concentrations

對藻生長的影響。培養4 d后藻的OD測定結果見表2。由表2可知，低濃度Cd(0.025 mg/L)顯著促進藻生長；0.050～0.100 mg/L沒有顯著毒害作用，超過0.200 mg/L時顯著抑制藻生長，說明Cd對藻具有低促高抑的作用。通過抑制率與Cd濃度作圖，按線性回歸曲線計算可得出Cd對藻D的半致死濃度(EC)為0.205 mg/L，毒性較高。

表2 藻對鎘耐受能力評估試驗結果

由表3可知，在24 h時藻D對Cd的吸附可能已經達到平衡，此時Cd被藻D吸附的最多，隨著時間的增加，有的藻已經死亡，然后又釋放出部分Cd，所以Cd濃度增加。Cd初始濃度0.200 mg/L處理時，藻D在24 h對Cd的去除率達到最大(33.79%)。

表3 藻對Cd的去除效果

由圖3可知，在0.200 mg/L鎘的脅迫下，藻D的C—H(2 960～2 850 cm)、C==O(1 690～1 650 cm)和—NH(3 500～3 300 cm)等基團吸收峰明顯比對照降低，推測鎘與藻細胞中的部分基團結合。

圖3 Cd對藻紅外光譜的影響Fig.3 Effect of Cd on the infrared spectrum of algae

3 結論與討論

已有研究表明，影響藻類吸附重金屬離子的因素有很多，主要包括微藻濃度的大小、微藻本身的細胞結構、光照、溫度、pH、鹽度、重金屬濃度、試驗時間等。該試驗中主要研究了重金屬Cd的濃度為0.100和0.200 mg/L，試驗時間為24和48 h的條件下，該藻對Cd的吸附能力，結果發現，當試驗時間為24 h、Cd濃度為0.200 mg/L時，該念珠藻對Cd的去除能力最強，去除率達到33.79%。已有研究表明，斜生柵藻對Cd的吸收能力最高，單位吸收率可達76.9%。由此可見，該念珠藻對Cd的吸附能力相對較弱，今后應進一步分離純化篩選Cd去除能力更強的藻株。

微藻對重金屬的吸附是一個復雜的物化和生化過程，是多種機理共同協作的結果，主要包括絡合機理和離子交換機理。藻類富含生化和礦物組分，尤其是一些官能團，如—OH、—COOH、—SH、—POO和—NH等在吸附過程中發揮很大的作用。根據該試驗紅外光譜數據顯示，在0.200 mg/L鎘的脅迫下，念珠藻D的C—H、C==O和—NH等基團吸收峰明顯比對照降低，所以認為吸附過程還有其他官能團的參與，但是此次試驗無法確定是哪些官能團，有待進行更深入的研究。現有研究表明，低濃度的Cd對藻的生長具有促進作用，高濃度的Cd具有抑制藻生長的作用。此次試驗結果顯示，低濃度Cd(0.025 mg/L)顯著促進藻生長；0.050～0.100 mg/L沒有顯著毒害作用；超過0.200 mg/L時顯著抑制藻生長，說明Cd對藻具有低促高抑的作用。

該研究用分子手段分析結果表明藻D與sp.NIES-2111親源關系最近。Cd毒性試驗結果Cd對藻D的EC值為0.205 mg/L，屬于高毒性。在0.200 mg/L的Cd的脅迫下，藻D的C—H、C==O和—NH發生改變，說明該藻對Cd的去除能力相對較弱，今后應進一步分離純化篩選對Cd去除能力更強的藻株。