基于16S rRNA 高通量測序技術探究補中益氣加減方對胃癌荷瘤小鼠腸道菌群的影響

陳亞玲 陳 旭 張瑞娟 孫慶敏

（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇南京 210029）

胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，其發病率和死亡率在胃腸道癌癥中均位居第二[1]。近年來對胃癌發病機制已有較深入的研究，但仍未完全明確。腸道微生態被稱為“被遺忘的功能器官”[2]，研究證實其與多種疾病相關，如炎癥性腸病和胃癌、結直腸癌等多種腫瘤。相關研究表明，胃腸道菌群產生的代謝產物可抑制胃癌發展，如促進腸道穩態、調節免疫環境、促進機體免疫應答[3-5]，又可促進胃癌細胞轉移[6]。

中藥服用方式主要為口服，進入胃腸道后必與腸道微生物接觸。補中益氣加減方是全國名中醫劉沈林教授結合胃癌的主要病機“脾氣虛損，癥瘕積聚”，由經典名方“補中益氣湯”化裁所得。臨床實踐證實，本方能明顯延長晚期胃癌患者的生存期，但其是否通過調節腸道菌群來發揮抗腫瘤作用目前尚未有報道。本課題組前期研究發現，補中益氣加減方可以降低外周血中程序性死亡受體1（PD-1）的表達，減少PD-1和PD-L1在腫瘤細胞中的浸潤[7]，提示該方可能通過調節腫瘤微環境中PD-1，從而抑制胃癌進展。另有研究表明，腸道微生物可通過干擾PD-1信號通路發揮抗腫瘤作用，現有臨床證據也提示PD-1抗體的治療效果部分依賴于患者腸道微生態[8]。本研究制作胃癌荷瘤小鼠模型，觀察補中益氣加減方對模型小鼠瘤質量的影響，并運用16S rRNA高通量測序技術，分析補中益氣加減方和PD-1抗體對胃癌荷瘤小鼠腸道菌群組成的影響，探討兩種藥物是否通過調節腸道菌群組成發揮抗腫瘤作用，為治療胃癌藥物的研究提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞和動物 MKN-28人胃癌細胞購自中國科學院上海生物科學研究所。細胞培養于含有10%新生牛血清的RPMI 1640培養基中，培養皿置于37 ℃、5%CO2的濕化培養箱中，隔日更換一次新鮮培養基，所有用于實驗的細胞傳代不超過7次。SPF級小鼠，體質量18～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-0010，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0069。小鼠飼養于南京醫科大學動物研究中心動物房，動物房室溫為20～24 ℃，飼料、飲水和鼠籠均嚴格消毒。本實驗通過南京醫科大學實驗動物倫理委員會審查，倫理編號：IACUC-1703033。

1.2 藥品與試劑 補中益氣加減方由黃芪、黨參、當歸、甘草、升麻、柴胡、白術、陳皮、三棱、莪術按30∶15∶10∶5∶6∶6∶10∶10∶15∶15的 比 例 配 伍 組 成，藥物飲片均由南京中醫藥大學附屬醫院中藥房提供。將藥材用1500 mL的雙蒸水浸泡30 min，先武火煮至沸騰，再文火煮30 min，倒出藥液；加1000 mL水重復上述步驟。混合2次煎煮所得的藥液，倒入鍋中濃縮至中藥濃度為1 g/mL。將濃縮的中藥2000×g離心15 min，3次，上清藥液置于4 ℃冰箱備 用。鼠 源PD-1抗 體（Bio X cell，美國，貨 號：BE0146），RPMI1640培養液（Gibco，美國），新生牛血清（Gibco，美國），DNA提取試劑盒（Thermo公司），AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）。

1.3 主 要 儀 器 1300A2型 生 物 安 全 柜，HERAcell 1501型CO2培養箱（Thermo公司）；-80 ℃超低溫冰箱（Thermo公司）；超純水機（millipore公司）；高速離心機（Thermo公司）；電子天平（Mettler公司）；HiSeq2500 PE250型測序系統（Illumina公司）。

2 實驗方法

2.1 造模 無菌條件下，將MKN-28人胃癌高轉移細胞消化重懸為3×107/mL。取24只小鼠，每只小鼠腋下皮下注射0.2 mL混勻的腫瘤細胞懸液，約為6×106個細胞。每日相同時間觀察小鼠的腫瘤生長情況，待瘤塊長到5 mm3時為造模成功，可以進行后續實驗。

2.2 分組與給藥 造模成功的小鼠隨機分為模型組、補中益氣加減方組（中藥組）和PD-1抗體組（陽性藥物組），每組8只。另取8只正常小鼠作為正常組。中藥組按每日25 g/kg體質量灌胃給藥，每日1次，連續24 d；陽性藥物組按每次10 mg/kg體質量，每3日1次腹腔注射給藥，共注射8次；正常組和模型組灌胃等體積的生理鹽水，每日1次，連續24 d。給藥開始后的24 d為給藥期。

2.3 小鼠體質量檢測 各組小鼠均從給藥第1天開始測量體質量，每6天測量1次。

2.4 小鼠瘤質量檢測 給藥期結束后脫頸椎處死小鼠，用手術剪剪開小鼠腫瘤周圍皮膚，用鑷子小心分離腫瘤附近組織，將剝離出來的腫瘤放在墊有錫箔紙的冰上。待所有腫瘤都取下后，稱重，記錄數據，按組別擺放、拍照。

2.5 糞便樣本收集 給藥期結束后將小鼠脫頸椎處死，用經酒精消毒的鑷子取盲腸部位內容物置于滅菌的EP管中，每只小鼠收集3～4顆，-80 ℃保存備用，用于16S rRNA高通量測序分析。

2.6 16S rRNA高通量測序技術檢測小鼠腸道菌群

2.6.1 DNA提取與測序 利用DNA提取試劑盒提取糞便中的總DNA，檢測DNA的純度和濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

2.6.2 PCR擴增 對16S rRNA基因V3-V4可變區進行PCR擴增，引物為338F（5’-ACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3’）。每個樣本重復3次，將同一樣本的PCR產物混合，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產物，純化，Tris-HCl洗脫，最后用2%瓊脂糖電泳檢測。

2.6.3 熒光定量 利用QuantiFluor?-ST（Promega，USA）進行熒光定量檢測，并按樣本的測序量要求，對其進行對應比例的混合。

2.6.4 構建文庫 使用Illumina MiSeq PE300測序儀將純化后的擴增片段構建為PE文庫，根據overlap關系對Miseq測序得到的PE reads序列進行拼接，并對其進行質控和過濾，得到優化序列，最終獲取操作分類單元（OTUs）。

2.6.5 生物信息學分析 對OTUs進行聚類分析和物種分類學分析，基于OTUs進行α多樣性分析和β多樣性分析。α多樣性指數分析物種的種類和豐富度，β多樣性指數分析物種的組間差異和組內差異。通過物種組成分析可發現小鼠腸道微生物區系在門水平和屬水平上的物種差異性。

2.7 統計學方法 數據使用GraphPad Prism 7軟件進行處理，結果以（xˉ±s）表示。2組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊則采用LSD檢驗，方差不齊則采用Dunnett's檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組小鼠體質量和瘤質量比較 如圖1-A所示，給藥期間各組小鼠體質量波動不明顯，給藥第24天，模型組與各給藥組小鼠體質量與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05），說明藥物在體內幾乎沒有明顯毒性作用。如圖1-B、圖1-C所示，與模型組比較，中藥組和陽性藥物組瘤質量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），中藥組與陽性藥物組組間瘤質量比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明中藥和PD-1 抗體對胃癌荷瘤小鼠腫瘤的生長均有明顯的抑制作用。

圖1 各組小鼠體質量變化（A）、給藥結束后瘤質量比較（B）和剝離后腫瘤形態比較（C）

3.2 各組小鼠腸道菌群多樣性比較 如圖2-A所示，小鼠腸道菌群的數量隨著樣本數量的增加而趨于某一恒定值，表明測序數據量合理，測序深度足以反映樣本中群落豐度水平。如圖2-B所 示，16S rRNA基 因V3-V4可變區的理論長度為400～440之間，將所有測得的序列進行統計，大部分序列的長度為400～420和420～440，即處于理 論長度范圍內，表明測序質量良好。如圖2-C所示，利用OTUs分布Venn圖分析組間菌群OTUs數量（OTUs數量又可代表群落豐度）和其種類交叉情況。各組特異性/總的OTUs數目分別為：正常組1309/8508、模型組6236/12 995、中藥組1110/7953、陽性藥物組462/5919，各組共檢測OTUs 17 905個，其中共有OTUs 3143個，為總OTUs數的17.55%。與正常組比較，模型組的OTUs數量升高；與模型組比較，中藥組和陽性藥物組的OTUs數量降低，接近于正常組。這一結果表明中藥和PD-1抗體可能降低了腸道菌群的整體水平和多樣性。

圖2 小鼠腸道菌群的Specaccum物種累積曲線（A）、優質序列分布（B）和各組小鼠腸道菌群OTUs分析（C）

α多樣性通過對腸道菌群的豐富度指數和多樣性指數進行分析來評估微生物的多樣性，包括豐富度指數（Observed_species、Chao1）和多樣性指數（PD_whole_tree、Shannon）。分析結果如表1所示，與正常組比較，模型組小鼠腸道菌群豐富度指數和多樣性指數均顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，中藥組、陽性藥物組小鼠腸道菌群豐富度指數和多樣性指數均顯著降低（P＜0.01）。與中藥組比較，陽性藥物組小鼠腸道菌群豐富度指數和多樣性指數均有所升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。結果表明，與模型組比較，中藥組、陽性藥物組的腸道菌群豐富度和多樣性均顯著降低，且趨近于正常組。

表1 各組小鼠腸道菌群的α多樣性指數分析（xˉ±s）

β多樣性可通過主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）來研究微生物群落間構成的差異。如圖3所示，模型組和正常組小鼠的腸道菌群明顯分開，表明這2組小鼠的菌群結構組成存在顯著性差異；中藥組接近正常組，表明其菌群多樣性和結構組成與正常組接近，可能和正常組存在著一定的關聯性。

圖3 各組小鼠腸道菌群的β多樣性分析

3.3 各組小鼠腸道菌群組成與結構分析

3.3.1 門水平腸道菌群組成 如圖4-A所示，除去部分未檢測出的菌門，主要由擬桿菌門 （Bacteroidetes）、厚 壁 菌 門（Firmicutes）、變 形菌門（Proteobacteria）等3個菌門組成，其中擬桿菌門和厚壁菌門的豐度在檢測出的菌門中比例達到90%以上。與正常組比較，模型組小鼠腸道中Bacteroidetes豐度降低，Firmicutes、Proteobacteria豐度升高，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，中藥組和陽性藥物組Bacteroidetes、Proteobacteria豐度升高，Firmicutes豐度降低，差異均無統計學意義（P＞0.05）。與正常組比較，模型組小鼠Firmicutes/Bacteroidetes值（F/B值）顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組、陽性藥物組小鼠F/B值顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。表明給藥處理后可回調小鼠腸道菌群的菌門水平和結構組成，從而發揮抗腫瘤作用。詳見圖4-B。

圖4 各組小鼠腸道菌群在門水平上的組成（A）、F/B值比較（B）

3.3.2 屬水平腸道菌群組成 小鼠糞便樣品中共檢測到212個菌屬，各組屬水平組成如圖5所示。測序結果發現，與正常組比較，模型組小鼠具有顯著性差異的菌屬有37個；與模型組比較，中藥組小鼠具有顯著性差異的菌群靶點有12個，陽性藥物組小鼠具有顯著性差異的菌群靶點有18個。此外如表2所示，我們發現與模型組比較，中藥和PD-1抗體可共同調節Muribaculum、Enterorhabdus、A n a e r o s t i p e s、B a r n e s i e l l a、Clostridium、Lacrimispora、Mediterraneibacter、Lactonifactor、Dorea、Streptococcus10個 菌 群 靶點（P＜0.01，P＜0.05），但 中 藥組和陽性藥物組組間的菌屬差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組小鼠腸道菌群具有顯著性差異菌屬的相對豐度值（xˉ±s）

圖5 各組小鼠腸道菌群在屬水平上的組成

4 討論

中醫學認為，胃癌是由飲食不節、正氣虛弱、情志內傷等多因素導致。中醫藥治療具有整體觀和辨證論治特色[9]，其強調的“整體觀”與微生態理論強調的“平衡與協調”相一致[10]。腸道菌群是由腸道內眾多的真菌和細菌等微生物組成，其組成改變可導致腸道微生態的變化，腸道平衡被打破與腫瘤發生發展密切相關。中醫藥可通過多種方式調節胃腸道微生態，使其達到平衡，如抑制病原菌在腸道中定植、促進免疫應答的產生[11]等，從而達到抗腫瘤作用。也有研究表明，中醫證候表型與腸道菌群相關[12]，特別是脾虛證[13]。有報道表明以健脾養胃法為主要治則的方藥可通過多靶點多層次的途徑調節腸道菌群，發揮抗腫瘤作用[14]。陳彬等[15]研究證實健脾解毒方可增加益生菌的數量，促進其定植和活性，抑制瘤體的生長。補中益氣加減方針對胃癌患者的基本病機“脾氣虛損”而擬，因此其可能也通過調節腸道菌群實現治療胃癌的目的。PD-1的配體PD-L1在幾種癌癥中高度表達，因此PD-1在癌癥免疫逃避中的作用已得到很好的證實。許多腫瘤細胞表達PD-L1，抑制PD-1和PD-L1之間的相互作用可以增強體外T細胞反應并介導臨床前抗腫瘤活性。

腸道菌群組成的變化可能改變腸道微生態，對患者的代謝和免疫功能造成影響，從而導致胃腸道疾病和自身免疫疾病[16]。朱燕燕等[17]運用PCRDGGE基因指紋圖譜技術檢測出了在胃癌患者和健康正常個體之間，腸道菌群的組成和結構存在顯著性差異。也有研究表明胃中的微生物參與致癌物的產生[18]，細菌過度生長是潛在的促癌因子[19]。本研究中Venn圖、β多樣性分析結果表明，造模使腸道菌群結構發生明顯變化，但其在給藥后逐漸恢復，接近正常組，表明補中益氣加減方和PD-1抗體可能通過改善小鼠腸道菌群的豐度和β多樣性發揮抗腫瘤作用。腸道菌群組成與結構分析表明，補中益氣加減方和PD-1抗體可回調3個菌門和10個菌屬。在門水平上，造模后Bacteroidetes豐度降低，Firmicutes、Proteobacteria豐度升高，給藥處理后回調。目前研究提示與胃癌相關的細菌，主要包括Streptococcus和Clostridium等[20-21]。Streptococcus感染與胃癌相關[22]，在胃癌中具有潛在的致癌作用[23]。Clostridium在胃癌組織中含量增加，并在胃癌患者胃微環境中定植[24]。有研究發現，Clostridium定植使Treg細胞發育的關鍵調節因子TGF-β含量增加，還可明顯促進Foxp3表達細胞的分化[25]。帶有Clostridium簇XIVa相關鞭毛蛋白特異性TCR的Foxp3+Treg細胞可以誘導腸道中的IgA+B細胞減少黏膜對微生物區系抗原的攝取，并阻止T細胞的激活[26]。Clostridium還可直接或間接將信號傳遞給條件樹突狀細胞，驅動Treg細胞或效應性T細胞的形成，影響Treg細胞的發育和功能[27]。Barnesiella可改變腫瘤的微環境，減少調節性T細胞，刺激同源的抗腫瘤細胞毒性T細胞（CTL）反應[28]。本研究結果表明，補中益氣加減方和PD-1抗體能夠改善胃癌荷瘤小鼠腸道菌群α、β多樣性，并對10種差異菌屬具有顯著回調能力，使腸道微環境由紊亂恢復平衡，表明其通過多靶點、多途徑發揮治療作用。

綜上，與模型組比較，補中益氣加減方和PD-1抗體單獨給藥均可明顯抑制胃癌荷瘤小鼠瘤質量，可有效改善胃癌荷瘤小鼠腸道菌群多樣性的變化，回調Streptococcus、Clostridium和Barnesiella等10個 相 關 菌屬，維護腸道微生態平衡，增強機體免疫，從而發揮抗腫瘤作用。本研究檢測指標補中益氣加減方和PD-1抗體組間差異不大，說明中藥的效果和PD-1抗體類似，表明補中益氣加減方抑瘤作用的潛在機制和PD-1抗體存在部分共同點，可能是通過它們共同調控的10個菌屬發揮作用，但詳細的機制還需進一步的實驗驗證。鑒于腸道菌群在腫瘤治療中的重要性，本課題組未來將聚焦于此次發現的10個差異菌屬在消化道疾病或消化道腫瘤中可能具有的功能，并對這些菌屬進行鑒定，從而研究是否能分離出可預防消化道疾病或腫瘤的益生菌。