基于UPLC-MS/MS的不同產地金觀音紅茶代謝組學分析

林潔鑫，顏廷宇，邵淑賢，王鵬杰，葉乃興，金 珊，吳芹瑤，鄭德勇，楊江帆

(1.福建農林大學園藝學院/茶學福建省高校重點實驗室，福建福州 350002；2.福建農林大學材料工程學院，福建福州 350002；3.福建商學院，福建福州 350002)

紅茶是我國六大茶類之一，屬于全發酵茶，由于其獨特的滋味和香氣成為世界上消費量最大的茶類。福建是紅茶的發明地，其主產區分布在閩東和閩中一帶，由于茶葉的品質與生長環境密切相關，使得不同產地的紅茶具有特定的品質特征。隨著人們生活水平提高，消費者對確認茶產品原產地的需求明顯增加，目前常用的茶葉感官審評方法，不僅其結果易受多種因素影響，也很難以據此判別茶葉的產地。因此，從保護消費者利益與福建茶葉區域品牌建設的需要出發，探究一種客觀、科學的茶葉產地與品質鑒別技術十分必要。

氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)、近紅外光譜(NRIS)、穩定性同位素(IRMS)、礦物質元素測定等檢測技術在鑒定食品的產地與品質方面取得一定成功，國內外學者開始將此類技術手段引入到茶葉的產地判別與品質鑒別研究中，并取得了重要進展。代謝組學作為一門新興綜合性技術，通過高通量檢測和多元數據處理方法將樣品檢測的全部信息系統性整合起來，具有耗時短、準確度高和廣覆蓋的特點，能夠在定性定量檢測樣品中小分子代謝產物的基礎上，提取出與樣品的品質或(和)產地關聯的關鍵信息，達到更全面、準確鑒別的目的。徐春暉等利用非靶向代謝組學分析方法結合多元統計分析對3種江西名茶品質構建預測模型，準確度可達100%，且3種茶葉的代謝物存在較大差異。鄭起帆等采用核磁共振氫譜技術(H-NMR)結合判別分析能較準確地對不同茶山普洱生茶進行分類，發現纈氨酸、綠原酸、奎尼酸等代謝物對不同茶山分型貢獻較大。王春波等利用超高效液相色譜-四級桿串聯飛行時間質譜技術和多元統計方法成功區分貴州3個不同產區都勻毛尖，并且篩選出6種差異顯著的產地標志物。目前關于不同產地紅茶的代謝組學研究仍較為欠缺。

筆者所在課題組曾利用代謝組學技術研究了福云6號制成的紅茶，顯著區分了紅茶的產地，并發現氨基酸和黃酮類物質對產于福建省福安市和尤溪縣的紅茶滋味品質間的差異具有重要貢獻。由于不同產地紅茶的滋味品質是受各種因素綜合影響的，為了更全面地比較分析2地紅茶品質的差異，進一步以金觀音單一品種制成的紅茶為研究對象，采用廣泛靶向代謝組學技術結合多元統計方法篩選差異代謝物進而區分不同產地的紅茶，分析形成紅茶滋味品質差異的可能原因，以期為福建紅茶的品質評價、產地鑒別及溯源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料共23份，于2020年3月分別收集自福建省尤溪縣的坂面鎮、臺溪鄉，以及福安市的城陽鎮、上白石鎮、社口鎮、松羅鄉；其中產自尤溪縣的紅茶有13份，產自福安市的紅茶有10份，全部茶樣均是金觀音單一品種制成的成品紅茶，且等級相似。參照GB/T 23776—2018茶葉感官審評方法，由6名高級評茶員對23份茶樣的滋味進行評價與評分，最后從2個產地各篩選出1份具有代表性的茶樣進行后續的代謝組學分析，試驗所用茶樣具體信息見表1。

表1 紅茶樣品信息

1.2 樣品制備方法

將樣品放入5 mL離心管，置于凍干機中真空冷凍干燥，用30 Hz的研磨儀研磨約1.5 min，再稱取100 mg樣品粉末，用1.2 mL 70%的甲醇水溶液溶解，每30 min渦旋提取30 s、重復6次后置于4 ℃冰箱過夜；經12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，使用0.22 μm濾膜過濾并儲存于進樣瓶中，2個產地的紅茶樣品，分別重復取樣3次、制備后進行UPLC-MS/MS分析。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流動相：A相為超純水(含0.1%甲酸)，B相為乙腈(含0.1%甲酸)；洗脫梯度：B相比例為5%→95%，時間0.00～9.00 min；B相比例95%維持9～10 min；B相比例95%→5%，時間10.00～11.10 min；B相比例降為5%平衡至14 min；柱溫 40 ℃；進樣量4 μL；流速0.35 mL/min。

1.4 質譜條件

利用電噴霧離子源(ESI)進行海量數據采集，溫度為550 ℃，離子噴霧電壓(IS)5 500 V(正離子模式)/-4 500 V(負離子模式)。在三重四級桿(QQQ)中，每個離子對根據優化的去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)進行掃描檢測。

1.5 數據處理

通過比較色譜保留時間、離子碎片值和相對豐度，并采用邁維(武漢)生物技術有限公司自建數據庫和公共數據庫對代謝物進行鑒定。利用三重四級桿質譜的多反應監測模式(MRM)對代謝物進行定量，獲得樣品的代謝物質譜數據并對其進行峰面積積分以及校正。采用R軟件(https：//www.r-project.org/)對鑒定的代謝產物進行PCA分析和OPLS-DA分析，利用OPLS-DA模型獲得的VIP值評分，根據VIP≥1、fold change≥2或fold change≤0.5進行顯著差異代謝物(SCMs)的篩選，同時通過代謝通路KEGG Pathways進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同產地紅茶代謝組學分析與代謝物的多元統計

利用廣泛靶向代謝組學技術，在尤溪紅茶、福安紅茶中共檢測到936種代謝物，PCA分析和OPLS-DA分析顯示，不同產地紅茶的代謝物能夠明顯分離(圖1-A、圖1-B)。根據OPLS-DA分析得到的VIP值(VIP≥1)和FC值(fold change≥2或fold change≤0.5)篩選差異代謝物，共篩選出96種顯著差異代謝物。火山圖(圖1-C)顯示，上調的代謝物有50種，即尤溪紅茶相對含量較高的差異代謝物有50種；下調的代謝物有46種，即福安紅茶相對含量較高的差異代謝物有46種。這些差異代謝物大致可分為11類，包括氨基酸及其衍生物、酚酸類、核苷酸及其衍生物、黃酮類、生物堿、脂質和有機酸等(圖1-D)，其中黃酮類、鞣質和脂質在尤溪紅茶中的相對含量更高，氨基酸及其衍生物、生物堿和有機酸在福安紅茶中的相對含量更高。

2.2 不同產地紅茶差異性代謝產物

2.2.1 主要差異代謝物 將差異代謝物的FC值進行log處理，得到差異變化在前20的差異表達代謝物(圖2)。與福安紅茶相比，尤溪紅茶有4種黃酮類[楊梅素-3--(6″-丙二酰)葡萄糖苷、7，4′-二--沒食子酰基特利色黃烷、楊梅素、圣草酚]，2種有機酸(2-甲基戊二酸、己二酸)，1種核苷酸及其衍生物(2′-脫氧腺苷)，1種酚酸類(綠原酸)和1種香豆素(7-甲氧基-5-異戊烯基氧基香豆素)的相對含量顯著高于福安紅茶；3種酚酸類(二氫咖啡酸、1，3，5-苯三酚、甲基丁香酚)，2種氨基酸及其衍生物(-乙酰--苯丙氨酸、--乙酰基--鳥氨酸)，2種核苷酸及其衍生物(-墨喋呤、環二-3′，5′-腺嘌呤核苷酸)，1種有機酸(馬來酸)和2種其他類(4-甲基-5-噻唑乙醇、香草醇苷)的相對含量明顯低于福安紅茶。結果表明，尤溪紅茶中相對含量較高的主要差異代謝物是黃酮類代謝物，而福安紅茶中的則是酚酸類代謝物。黃酮類和酚酸類均屬于多酚類物質，而多酚類物質的積累有利于形成醇厚鮮爽的滋味口感，由此可以推測，黃酮類和酚酸類物質在2個產地紅茶滋味風格的差異上有一定的貢獻。

2.2.2 主要差異代謝物熱圖 為了更直觀地觀察尤溪紅茶、福安紅茶差異代謝物之間的變化，我們得到了96種差異代謝物的熱圖(圖3)，其中有6種氨基酸及其衍生物、7種核苷酸及其衍生物、18種黃酮類、5種鞣質、24種酚酸類、11種生物堿、11種有機酸、4種木脂素和香豆素、1種萜類、5種脂質和4種其他類物質。

游離氨基酸是茶葉中具有生物活性和味覺活性的物質，可賦予茶湯復雜的口感，如鮮味、甜味和苦味等，是影響紅茶風味的重要因素。根據VIP值和FC值結果，發現2個產地紅茶差異代謝物中 5-氧化脯氨酸、-丙酰甘氨酸、-天冬酰胺、--乙酰基--鳥氨酸、-乙酰--苯丙氨酸和-單甲基--精氨酸等6種氨基酸及其衍生物存在顯著差異，且福安紅茶中的含量都明顯高于尤溪紅茶，其中呈鮮味的-天冬酰胺的含量是尤溪紅茶的2.3倍，這可能是由于2個產地地理位置的差異造成太陽光照強度不同引起的，與Ji等的研究結果一致。有研究發現，嘌呤類的核苷酸會呈現鮮味，雖然這種呈味核苷酸自身的鮮味較弱，但對茶湯滋味中的甜味、鮮味以及醇厚感起到一定的增強效果。從圖3可以看出，福安紅茶中的呈味核苷酸環二-3′，5′-腺嘌呤核苷酸和煙酸腺嘌呤二核苷酸的含量分別上調7.8倍和下調50%，所以認為呈味核苷酸可能會促進紅茶鮮味的呈現，這與2個產地紅茶的感官審評結果相似。

多酚類物質包括黃烷醇類、酚酸類和黃酮醇類等，是紅茶中苦澀味和收斂性的主要成分。由圖3可知，與福安紅茶相比，尤溪紅茶中相對含量較高的黃酮類代謝物有18種，增幅由大至小依次為楊梅素-3--(6″-丙二酰)葡萄糖苷、7，4′-二--沒食子酰基特利色黃烷、楊梅素、圣草酚、槲皮素-3--(6″-沒食子酰)半乳糖苷、丁香亭、楊梅素-3--蕓香糖苷、表兒茶素、楊梅素-3--半乳糖苷-3′--鼠李糖苷、3，3′，4′，5，5′，7-六羥基黃酮、二氫槲皮素、楊梅素-3--葡萄糖苷、槲皮素-3--(6″-乙酰)半乳糖苷、3，3′，4′，5，7-五羥基黃烷(4→8)-3，3′，4′，5，7-五羥基黃烷、沒食子兒茶素、3，3′，4′，5，7-五羥基黃烷-(4→6)-3，3′，4′，5，7-五羥基黃烷、芹菜素-7--蕓香糖苷和5，7，3′，4′，5’-五羥基黃烷，其中非酯型兒茶素沒食子兒茶素和表兒茶素分別顯著上調2.1倍和2.4倍，這可能是由于2個產地地理區域的差異形成的。尤溪紅茶中有6種黃酮醇類含量明顯高于福安紅茶，其中楊梅素含量顯著上調3.5倍，相關研究表明，高海拔低緯度的區域，有利于合成較多的黃酮類化合物，其中黃酮醇類物質與茶湯滋味的厚度和鮮味呈反比，這有助于說明尤溪紅茶中黃酮醇類代謝物含量更高的原因。

生物堿的主要成分為咖啡堿、茶堿和可可堿等，與茶湯的典型苦味密切相關，容易與兒茶素形成氫鍵絡合物，提高茶湯滋味的鮮爽度和醇度，而在尤溪紅茶、福安紅茶中鑒定到的11種生物堿中，有9種生物堿(2-苯乙胺、異喹啉、-乙酰腐胺、色胺、吲哚-3-乙酸、1-甲氧基吲哚-3-甲醛、茶堿、乙酰色胺和二氫咖啡酰腐胺等)的含量在福安紅茶中更高，其中茶堿的含量是尤溪紅茶的2.3倍，所以這些生物堿在一定程度上會影響福安紅茶的滋味特征。從圖3可以看出，在鑒定到的有機酸代謝物中，大部分在福安紅茶中顯著累積，馬來酸累積最高，明顯上調3.5倍。除此之外，福安紅茶中的2種溶血磷脂酰乙醇胺和1種溶血磷脂酰膽堿含量明顯高于尤溪紅茶，Li等研究已證實，磷脂的顯著降解與綠茶香氣的形成有重要關系，因此這3種磷脂降解產物可能對紅茶香氣的形成有一定的影響。

2.3 不同產地紅茶差異代謝物通路

通過KEGG通路分析，共鑒定出41條代謝通路，被KEGG注釋到的具有明顯差異的代謝物個數為40個，其中有15個差異代謝物在尤溪紅茶中相對含量較高，25個差異代謝物在福安紅茶中相對含量較高，主要分布在20條代謝通路中(圖4)，其中顯著富集(值<0.05)的通路為苯丙氨酸代謝通路(Phenylalanine metabolism)和黃酮類生物合成通路(Flavonoid biosynthesis)，從一定程度上可以認為，這2條代謝通路對于不同產地紅茶的滋味品質具有重要意義，這與Wu等的研究結果相符，說明代謝通路中涉及到的差異代謝物可以作為區分2個產地紅茶品質差異的重要依據。

研究結果表明，苯丙氨酸代謝通路富集了苯丙酮酸、2-羥基苯乙酸、2-苯乙胺、-乙酰--苯丙氨酸和2-苯乙醇等5種明顯差異的代謝成分，黃酮類生物合成通路富集了圣草酚、表兒茶素、楊梅素、沒食子兒茶素、二氫槲皮素和綠原酸等6種明顯差異的代謝成分，從相對豐度(圖5)可以看出，苯丙氨酸代謝通路中的5種差異代謝物在福安紅茶中的相對含量更高，其中-乙酰--苯丙氨酸上調3.5倍、2-苯乙胺上調2.6倍，2-苯乙胺作為一種神經遞質，可以提高細胞外液中多巴胺的水平，具有使人感到身心愉悅的效果；與此相反，黃酮類生物合成通路中的6種差異代謝物則在尤溪紅茶的相對含量更高，其中圣草酚、綠原酸含量較高，分別上調了3.3、3.0倍，綠原酸在茶湯中呈苦澀味，會隨著濃度的增加而增強。由此可見，苯丙氨酸代謝通路和黃酮類生物合成通路作為關鍵通路，在不同產地紅茶的品質差異中起主要作用。

3 討論與結論

紅茶獨特的滋味和香氣是由多種呈味成分協同作用的結果，而差異代謝物賦予了不同產地紅茶的品質特征。相關研究認為，氨基酸和黃酮類差異代謝物可能是形成由福云6號品種制成的不同產地紅茶滋味品質差異的原因，其中紫云英苷、表兒茶素、-谷氨酰胺、-天冬氨酸、-賴氨酸、-色氨酸、-谷氨酸、綠原酸、苯乙胺和牡荊素-2″--鼠李糖苷等差異代謝產物具有重要貢獻。

在此基礎上，本研究進一步探究不同產地金觀音紅茶代謝產物的差異，共篩選出96種明顯差異代謝物，其中氨基酸及其衍生物(-天冬酰胺、-乙酰--苯丙氨酸等)、生物堿(茶堿、2-苯乙胺等)、酚酸類(二氫咖啡酸、甲基丁香酚等)等代謝物的相對含量在福安紅茶中較高，黃酮類(楊梅素、圣草酚、丁香亭、表兒茶素等)代謝物的相對含量在尤溪紅茶中較高，因此認為這些明顯差異代謝物對不同產地紅茶滋味品質差異的形成具有重要意義；苯丙氨酸代謝通路、黃酮類生物合成通路作為關鍵通路，在不同產地紅茶的代謝差異中起重要作用，其中苯丙酮酸、2-羥基苯乙酸、2-苯乙胺、-乙酰--苯丙氨酸、2-苯乙醇、圣草酚、表兒茶素、楊梅素、沒食子兒茶素、二氫槲皮素和綠原酸等可以作為區分不同產地紅茶的重要依據。運用本研究結果，進一步探明了福安紅茶、尤溪紅茶品質特征差異的代謝物基礎，可為福建省福安市、尤溪縣今后紅茶產品開發和生產提供參考依據。