水稻長鏈非編碼RNA的研究進展

于雪然，薛欣月，田 穎，杜懷東，李培富，馬天利

(寧夏優勢特色作物現代分子育種重點實驗室/寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021)

1992年首次在人類中發現了長鏈非編碼RNA(lncRNAs)。它最初被認為是一種不具備功能的“轉錄噪音”，是一段不具備編碼功能的RNA序列。隨著研究的不斷深入，人們逐漸意識到lncRNAs在基因的表達調節中起著重要的作用。1999年，古井宏等在對水稻和轉基因大豆的表達分析中也發現了lncRNA，這是一個與水稻根瘤菌形成有關的lncRNA-。通過表達分析表明，水稻與豆科植物具有共同的特性，并且可能在莖維管束的分化過程中起作用。

當前，水稻作為主要糧食作物之一，是世界上大部分人口的主食。已有研究表明，水稻中lncRNAs不僅參與水稻多個生長發育過程，而且在水稻參與非生物逆境反應及病害防御等過程中也發揮重要功能。雖然近年來植物lncRNAs的研究取得了一些進展，但是總體而言，水稻lncRNAs的研究還不夠深入。本文就近年來水稻中已發現的lncRNAs的種類、參與的生物學過程、發揮的作用機制及與水稻相關的lncRNAs生物信息數據庫進行綜述及展望，期望能為更深入地了解水稻中的lncRNAs提供借鑒。

1 水稻lncRNAs的相關數據庫

人們在研究核糖核酸的過程中發現了許多形狀大小各不相同的非編碼RNAs。非編碼RNAs基因的進化與蛋白質編碼基因的進化有所不同，在大多數情況下，蛋白質編碼基因都是通過部分復制和后續序列的差異過程產生的。lncRNAs的進化主要是由于從影響染色質調節、增強子功能或其他過程的各個啟動子中選擇轉錄而來，且隨時間流逝可以獲得調控因子的結合位點。lncRNAs的形成大致通過以下5種方式完成：(1)一個蛋白質編碼基因框架被破壞，從而突變轉化成為一個功能性非編碼RNA，同時整合了轉座因子序列。(2)隨著染色體重排后，2個未轉錄的序列區域和先前分離良好的序列并置，產生1個多外顯子非編碼RNA。(3)通過反向轉座復制非編碼基因，產生功能性非編碼反向基因或非功能性非編碼反向假基因。(4)非編碼RNA中的相鄰重復是由2個串聯重復結構產生的。(5)功能性非編碼RNA來源于轉座因子的插入或分離。

隨著植物中的lncRNAs不斷被發現和深入研究，與植物lncRNAs相關的生物信息數據庫也相繼出現，如LncRNAdb、PLncdb、PlantNATsDB等。已知lncRNAs在水稻生長過程中對部分基因的表達起調節作用，但具體的作用機制和調控途徑研究有限，特別是在生物技術、農業和基礎研究等方面具有重要作用的lncRNAs仍缺乏全面的鑒定和功能注釋。下邊列舉主要和水稻相關的數據庫以期為后續的研究提供有效依據(表1)。

表1 水稻lncRNAs相關數據庫

CANTATAdb數據庫由最初的10種模式物種擴展到現在的39個物種，收錄了大部分植物的lncRNAs信息，數量高達239 631種lncRNAs，是植物最大的lncRNAs數據庫。其中包括已知的水稻lncRNAs，共38 529種，轉錄數達450 170個。

GreeNC數據庫收錄了49個物種的lncRNAs，其中包括37種植物和6種藻類，總lncRNAs超過120 000個，具有不少于20萬條帶注釋的轉錄本。其中與水稻有關的lncRNAs有 4 495 個。

PLNlncRbase涵蓋了43種植物的lncRNAs，共 1 187 個。具有可以使用植物種類名稱或lncRNAs標識符搜索，以及從界面中檢索植物lncRNAs條目等優點。

EVLncRNA是經過低通量實驗驗證的lncRNAs數據庫，包括lncRNAdb、LncRANDisease、Lnc2Cancer和PLNIncRBase，以及其他先前未涵蓋的功能和特定信息所建立的lncRNAs，共1 543個。其中有428個lncRNAs是來自44個植物物種的，這之中也包括部分水稻的lncRNAs。

PNRD是植物的微小核糖核酸(miRNA)數據庫，滿足了對植物miRNA研究的需求。充分利用大量公共資源的方法，為植物非編碼RNA(ncRNA)的基礎研究提供了便利。目前該數據庫已從150種植物中收集了11類不同類型的ncRNA，共計25 739種。包括 lncRNAs、tRNA、rRNA、tasiRNA、snRNA 和 snoRNA 等。其中已經驗證的水稻lncRNAs有38個，未預測具體功能的水稻lncRNAs有1個。

PLncPRO是一個利用轉錄組數據，使用隨機森林算法對編碼和長非編碼數據進行分類，從而預測植物中非編碼基因的數據庫。與其他現有工具相比，PLncPRO具有更好的預測精度。在干旱或鹽脅迫條件下，利用PLncPRO在水稻中發現了3 714個高置信度lncRNAs。

IC4R-2.0包含3 215個lncRNA位點和6 259個轉錄本，但沒有相關的多組特征。該數據庫，在水稻基因組中系統地表征了長鏈非編碼 RNA(lncRNA)和環狀 RNA(circRNA)。性能評估結果表明，與之前的注釋系統相比，IC4R-2.0 實現了更高的完整性和質量，這主要歸功于應用了大量的基因組注釋RNA-Seq 數據。

PLncDB V2.0根據13 834個RNA-Seq數據集整理得到了80種植物的1 246 372個lncRNAs，這其中包含從98個RNA-Seq文庫中鑒定的 11 565 個水稻lncRNAs信息。PLncDB V2.0整合來自其他4個資源(包括EVLncRNA、RNAcentral等)的lncRNAs信息，界面友好，具有很多特點，例如可以使用多種工具可視化lncRNA表達模式和表觀遺傳信號，具有高達5個內置搜索引擎用于lncRNAs的研究，還提供了lncRNAs的可能靶標和調控網絡。

RiceLncPedia是一個精選的水稻 lncRNAs 數據庫，包括2 312個公開可用的RNA-Seq文庫，6 965個水稻 lncRNAs。并按以下方式分為5類：(1)lncRNAs在不同組織、發育階段和脅迫處理中的表達譜；(2)lncRNAs與基因組變異的關聯；(3)lncRNAs與表型的聯系；(4)lncRNAs和轉座子元件的重疊信息；(5)預測為miRNAs靶標或miRNA前體的lncRNAs。

2 lncRNAs在水稻生長發育中的作用

隨著全基因組芯片及高通量測序數據的不斷積累，研究發現在現有的物種中，大部分基因組是可以轉錄的，但只有大約2%的基因可以編碼基因組。近年來，對基因的特異性和高通量研究發現，水稻中的一些lncRNAs參與多種生物學功能的調控過程，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，以RNA的形式在多種層面上參與調節水稻的分子生物學功能，包括水稻的生殖生長、抗逆及脅迫過程等。研究證明，lncRNAs作為一種生物調節因子參與了水稻的生命調節過程，在水稻不同的生長發育過程中具有特異性，在水稻的生長發育過程中起到了非常重要的作用。

2.1 非生物脅迫

非生物脅迫是水稻生長發育中常見的抑制因素。水稻需要優化其生長和代謝過程，來適應環境的變化。研究發現，水稻中的非生物脅迫，如低溫、高溫、干旱、鹽堿、重金屬等均與lncRNAs有關(圖1)。許多表達下調多聚腺苷酸化(DPA)的lncRNAs通過參與激活多組應激反應基因的方式，影響水稻脫落酸的生物合成、轉運和代謝過程。當水稻所處環境溫度過高或過低時，一些DPA lncRNAs通過負調控相關酶活性的方式參與水稻的抗逆過程。Shin等發現1種lncRNA()在冷處理條件下，參與了幼苗的應激反應。Leng等在鑒定水稻孕穗期的冷敏感lncRNAs時，共得到1 485個lncRNAs，其中有566個被發現有差異表達。Luo等研究發現，暴露于高溫脅迫下的水稻受精10 d后，在收獲的穗中鑒定得到了578個lncRNAs，其中包括14個顯著上調表達基因及45個顯著下調表達基因。在這59個差異表達的基因中，有32個被預測到參與了淀粉的代謝和分解過程，表明這些基因參與胚乳淀粉的形成，從而進一步影響堊白的形成。Qi等研究發現，在干旱脅迫下，鑒定得到 1 092 個與lncRNAs有關的差異表達基因，該結果為水稻品種抗旱性的遺傳改良提供了候選調控因子。Li等在水稻干旱反應研究過程中發現，有 6 885 個轉錄本和238個lncRNAs參與其中。作為的前體，調節關鍵基因，通過參與脫落酸信號傳導的方式，調節水稻短期干旱記憶的過程。此外，Yuan等發現，一些與干旱有關的DPA lncRNAs參與了細胞壁的加厚和脫落酸的轉運過程。Singh等在對水稻鹽脅迫的研究中發現，水稻中有3 714個高置信度的lncRNAs參與該過程，其中有27.2%的lncRNAs至少在1種脅迫中差異表達。

目前已有轉錄組學相關研究表明，水稻中存在大量的lncRNAs，且此類lncRNAs在水稻細胞對氮磷的反應、磷饑餓和非生物脅迫等相關通路中均有注釋。Shin等發現，在氮磷缺乏的情況下，的表達發生改變。這表明，可能參與了氮磷平衡的調控。在氮磷饑餓條件下，在水稻根中表達水平增加。在缺氮根中，表現出對氮饑餓反應的誘導表達模式。

許多lncRNAs在鎘、砷和鐵等金屬脅迫下發揮作用。鎘、砷等金屬是植物生長發育過程中的非必需元素，日益加劇的鎘、砷污染與水稻生產有直接關系，其在水稻中的可食用部分大量增加，嚴重影響了人類的健康。Chen等利用基因組測序技術發現，lncRNAs可以通過選擇性剪接及標靶模擬物的方式參與控制水稻的鎘代謝過程，使與半胱氨酸和甲硫氨酸代謝途經相關的基因發生顯著變化。通過這些研究可知，在鎘脅迫下，lncRNAs通過順式調節富含半胱氨酸的代謝基因，反式調節光合作用和次生代謝物來減輕鎘的毒性，從而激活各種生理生化反應。Tang等在研究水稻對砷脅迫的lncRNAs的響應中發現了56個lncRNAs，表明lncRNAs參與了砷脅迫的信號傳遞。

鐵缺乏會直接影響水稻的生長發育，導致水稻產量和品質下降。Wang等發現，有171個lncRNAs在缺鐵條件下在水稻莖和根中被鑒定出來，其中有數個lncRNAs可以作為miRNAs或內源性標靶模擬物來調節鐵相關基因的表達。許多lncRNAs參與了水稻的鐵轉運過程及光合作用，表明lncRNAs在調節鐵穩態中起作用。

2.2 生物脅迫

生物脅迫在水稻生產中存在著嚴重的風險。為了應對這一系列風險，水稻已經進化出一套防御機制。近年來研究發現，lncRNAs是水稻應對脅迫機制的重要組成部分(圖2)。

水稻是全世界最主要的谷類作物之一，但在許多地區，由于稻瘟病的影響，水稻產量出現了嚴重損失。Jain等在研究水稻接種稻瘟病病菌時，從3種不同的抗性水稻品系中分別發現了1 429、1 927、1 981個lncRNAs參與其中。Wang等發現了與稻瘟病病菌相關的水稻基因，其中有83個lncRNAs在感染稻瘟病病菌后上調，78個下調，其中1個上調的lncRNAs來源于茉莉酸合成基因，茉莉酸調節水稻的稻瘟病抗性，由此可知lncRNAs可通過參與茉莉酸的合成調節水稻稻瘟病的抗性。Tang等在水稻的感染和發育過程中發現了與稻曲病相關的lncRNAs，并對其做了RNA-Seq分析，得到了1 724個lncRNAs。Cao等研究水稻防御黑條矮縮病毒(RBSDV)和條紋病毒(RSV)時，發現了1 925個lncRNAs。其中可能以脫落酸通路中涉及的脫落酸應答元件結合因子()()為靶點，通過靶向病原體的方式參與脫落酸信號通路，從而影響脫落酸的表達。Zhang等對感染和未感染黑條矮縮病毒的水稻進行了轉錄組分析，發現22個lncRNAs被鑒定為差異表達基因，其中大多數基因參與水稻和病原體的相互作用，并在感染后表現為上調表達。

了解昆蟲lncRNAs的特性和功能對于水稻病蟲害防御有很大作用。Xiao等在研究褐飛虱對水稻的影響中檢測到2 439個lncRNAs，這些lncRNAs在褐飛虱的高繁殖力和毒力適應性方面均有重要作用。Chen等對條紋葉枯病病毒在灰飛虱中的傳播過程中發現，lncRNA()可能參與了水稻免疫系統抵抗病毒入侵的活動。袁祝婷對褐飛虱lncRNAs基因的表達及功能分析中發現，lncRNAs參與了褐飛虱的生殖發育，通過干擾褐飛虱的生殖過程可以達到阻止病毒傳播的目的。研究發現，lncRNAs有可能在未來發展成為有價值的抗植物病原體的分子農藥。

2.3 生長發育

lncRNAs在調節水稻的生長發育方面也發揮著重要作用(表2)。Wang等研究發現了1種由相鄰基因簇的反義鏈轉錄而來的lncRNA，命名為。過表達時，幾個基因表達水平上調，達到水稻增產的效果。Zhang等研究發現，和作為標靶模擬物作用于相關基因，其在雌蕊、花藥、早期穗及種子的表達中極高，在穗部發育和繁殖中也發揮作用。這些結果表明，lncRNAs可以調節花和種子發育，在穗發育和繁殖中也發揮著重要作用。Wang等證明了通過靶向模擬的方式減弱了osa-miR160在花藥發育早期對(mRNA)的抑制，通過負調控osa-miR160的方式增強了的表達。上述研究表明具有靶向模擬功能的lncRNAs可能作為時間調節因子來調節特定發育階段的miRNAs的作用，以此參與水稻的生殖生長過程。Luan等報道了可能是來源于基因的反義lncRNA，其表觀遺傳修飾在水稻穗部發揮作用。Wang等發現了與種子形態和葉片形態相關的基因和。這些lncRNAs在水稻生長發育中起重要作用。內源性 lncRNA()是從水稻中轉錄因子基因座的相反鏈轉錄而來的，的下調和的過表達都會導致轉基因水稻的葉片畸變，表明可能順式調控，使葉片形態在生長過程中發生改變。

表2 lncRNAs在調控水稻生長發育中的作用

雄性不育系是雜交水稻育種過程中的一個重要基礎。Fan等發現由光周期敏感雄性不育()基因座產生的lncRNAs與水稻光周期敏感不育有關。位點參與的編碼過程。在長日照條件下，參與了花藥的積累過程。當這些lncRNAs積累到一定水平時，會導致雄性不育。Ding等克隆了1個長度為1 236個堿基的基因，用于控制光周期敏感雄性不育，命名為。在長日照條件下，水稻花粉的正常發育需要一定水平的基因表達量，而是通過影響啟動子區域的DNA甲基化來調節水稻光周期敏感雄性不育。

Liu等在水稻生殖發育過程中發現了大量的lncRNAs。預測這些lncRNAs可能參與了水稻細胞減數分裂、有絲分裂及雌配子體的發育等過程。在此過程中，lncRNAs可能通過作用于相關基因、作為miRNA前體或誘餌分子等機制參與水稻胚珠發育和雌配子體敗育。但這一研究仍處于預測階段，具體功能仍待進一步驗證。

綜上所述，水稻lncRNAs調節光周期敏感雄性不育、減數分裂前生殖細胞的發育、減數分裂的進程、胚珠發育和雌配子體發育的過程，從而調節水稻生殖過程。lncRNAs通過影響重要的農藝性狀，如籽粒產量、雄性不育和葉型，在調節水稻生長發育中起著復雜的作用。lncRNAs的功能不僅僅是在應激反應中，還有更多lncRNAs在細胞發育過程、激素信號和生理需求中的功能還有待探索。對水稻生長發育相關基因的進一步研究可能會促進水稻產量、品質等的提高。

3 展望

現有的科學研究豐富了水稻lncRNAs的研究內容，補充了該領域的研究范疇，填補了研究空白，對水稻lncRNAs的發展具有非常重要的作用。展望未來，可以從以下幾個方面加強lncRNAs的深入研究。

(1)lncRNAs的結構復雜，樣本數量不足，識別較為困難。雖然存在許多lncRNAs數據庫，但大多數數據庫只關注少數特定物種，對于水稻lncRNAs注釋的數量很少。許多已發表的報告證實了水稻lncRNAs的關鍵生物學作用(例如細胞分化、基因調控、脅迫響應等)。然而，對于這種特定的lncRNAs，仍然缺乏以水稻lncRNAs為主的數據存儲和功能注釋的數據庫。目前已知的水稻相關lncRNAs數據庫規模很小(僅包含數百個lncRNAs)，并且在其重點(疾病或相互作用)方面具有特定性。對此，可以針對水稻實現統一的數據庫管理，提出相應的lncRNAs注釋及預測，有效提高水稻lncRNAs的研究。

(2)lncRNAs預測軟件在動物上特別是癌癥方面研究較多，在植物上，尤其是水稻方面研究較少，目前還沒有一種科學界一致同意的預測方法，因此很難進行跨物種的比較。如果想進一步探究 lncRNAs在水稻中的調控機制，還需要結合多個學科進行研究，如生物信息學、遺傳學等。同時，隨著相關技術的進一步發展，我們將對lncRNAs的功能和機制進行更加完整的理解和研究。lncRNAs也將在作物遺傳育種、生物資源開發、植物細胞工程等領域發揮更加重要的作用。

(3)雖然目前對lncRNAs在水稻中的功能研究越來越多，但有關水稻的研究仍然較少。目前已有大量研究發現lncRNAs參與水稻脅迫、抗逆及生長發育等過程，但針對其響應的全面調查仍然有限，許多lncRNAs仍然不知道確切的基因組注釋和功能意義。隨著lncRNAs新的來源不斷被發現的同時，其分類的方法也應不斷更新。此外，lncRNAs并不是以單一的方式發揮作用，通常與其他非編碼基因和蛋白編碼基因相互作用而發揮功能。目前很多研究都表明lncRNAs可與miRNA相互作用發揮調控機制，一條lncRNA可能受不同作用機制影響。加強對lncRNAs功能方面更加科學有效的研究，使lncRNAs在水稻育種、種質創新等方面發揮更重要的作用。