8種中草藥材提取物體外抗人肺炎支原體活性研究

柴 琳，張 俊，李 萌，趙若蓮，劉榮均，李云芬

（云南中醫藥大學第三附屬醫院，云南 昆明 650011）

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是一種主要引起上、下呼吸道感染的病原體［1-2］，可以導致呼吸道感染、支氣管炎、哮喘、不典型肺炎等一系列疾病。本病原體常感染學齡兒童及老年人，約占呼吸道感染疾病的20%。目前，治療肺炎支原體肺炎（MPP）的首選藥物是大環內酯類抗生素，隨著臨床MP耐藥菌株的不斷增加，使臨床治療效果降低。由于中藥的特殊性，細菌較少對其產生耐藥，本研究擬根據8種中藥對肺炎支原體的體外抑菌試驗，篩選出對肺炎支原體有較好抑菌和殺菌效果的中草藥材，為中藥院內制劑開發和中醫臨床用藥提供實驗及理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

中草藥：云南石斛（dendrobium）、遼寧板藍根（radix isatidis）、云南臭靈丹（Laggera pterodonta）、甘肅半夏（pinellia ternate）、四川魚腥草（herba houttuyniae）、河北黃芩（radix scutellariae）、安徽桔梗（Platycodon grandiflorum）、河南艾葉（folium artemisiae argyi）。

實驗菌株：肺炎支原體2株流行株ATCC15531、ATCC29342和4株耐藥株MP8、MP10、MP19、MP47（均來源于昆明醫學生物學研究所）。

培養基：PPLO液體培養基。

實驗設備：貝克曼離心機、山東新華電熱蒸汽壓力滅菌器、力康電熱恒溫培養箱。

1.2 方法

中藥原液制備：中藥原液的制備采用二次煮沸法。稱取8種中藥100g，加入蒸餾水300mL浸泡20min，強火加熱煮沸，文火煎煮30min，攪拌，過濾；藥渣再加入蒸餾水150mL按上法煎熬、過濾；兩次藥液合并濃縮成100mL，用NaOH調pH值至7.6～7.8，取50mL作為未離心藥液備用，剩余50mL置離心管中4000r/min離心10min；121℃高壓蒸汽滅菌20min后，作為中藥原液（1mL藥液相當于原藥材1g），存放4℃冰箱貯存備用。實驗前以MP液體培養基稀釋。

中藥液的稀釋：采用倍比稀釋法，對離心和未離心藥液進行相同處理。（1）取中藥原液125μL加入液體培養基875μL配為125.00mg/mL藥液①；（2）取藥液①250μL加入液體培養基750μL配為62.50mg/mL藥液②；（3）取藥液②250μL加入液體培養基750μL配為31.25mg/mL藥液③；（4）取藥液③250μL加入液體培養基750μL配為15.63mg/mL藥液④；（5）取藥液④250μL加入液體培養基750μL配為7.81mg/mL藥液⑤；（6）取藥液⑤250μL加入液體培養基750μL配為3.91mg/mL藥液。

肺炎支原體菌株的復蘇培養：ATCC15531、ATCC29342、MP8、MP10、MP19、MP47的凍干菌株（昆明醫學生物學研究所保藏）接入PPLO液體培養基中，37℃培養1周。培養基由紅變黃，再次轉接到PPLO液體培養基中，37℃培養5天，即為MP-2（第2代）。

MP工作菌液的制備：將凍干保存的肺炎支原體菌種，用PPLO液體培養法連續傳代，取第3代，采用顏色變化單位（ colour change units，CCU）方法測定MP濃度，用MP液體培養基稀釋到104～ 105CCU /mL，作為工作菌液。

最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）測定：采用微量稀釋法測定其最低抑菌濃度（MIC值）。在12×8孔聚苯乙烯微量板上試驗：第1孔加入100μL培養基和100μL工作菌液作為陽性對照。從2～11孔分別加入100μL稀釋藥液和100μL工作菌液，每個濃度做3個，第12孔加入200μL培養基，為陰性對照；藥物濃度從第2孔開始依次為125.00mg/mL、62.50mg/mL、31.25mg/mL、15.63mg/mL、7.81mg/mL、3.91mg/mL；同時，做每個藥液濃度加培養基的對照，排除藥液的顏色干擾；滴入無菌液體石蠟密封，蓋上板蓋，輕搖混勻，用封口膜封邊，置電熱恒溫培養箱內37℃孵育48h～96h后觀察結果。利用MP的生長代謝產物，可以改變培養液的pH值，從而引起其中指示劑變色的特點，來判定MP的生長狀況，即陽性對照孔發生顏色改變（即培養液中酚紅指示劑由紅色變為橘黃色）且無混濁，加藥孔不再出現顏色變化的最小藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。

2 結 果

2.1 最小抑菌濃度MIC

采用微量稀釋法測得8種中草藥提取物體外抗肺炎支原體MIC結果，結果如表1所示。從實驗結果可以看出，所選的7種中草藥粗提藥液以及藥液的濃度對2株ATCC15531、ATCC29342肺炎支原體流行株有一定的抑制作用：艾葉、桔梗、黃芩、臭靈丹和板藍根對MP的抑制作用最強，MIC均為3.91mg/mL；魚腥草次之為15.63mg/mL；石斛作用最弱為62.50mg/mL；而半夏對MP無抑制作用。與此相似，對4株肺炎支原體耐藥株，艾葉、桔梗、黃芩、臭靈丹和板藍根的抑制作用最強MIC均為15.70mg/mL；魚腥草次之為31.30mg/mL；石斛作用最弱為125.00mg/mL。因此8種中藥對MP流行株和耐藥株的抑制順序相同，依次為：艾葉、桔梗、黃芩、臭靈丹、板藍根抑制作用最強，魚腥草次之，石斛抑制作用較弱，半夏無抑制作用。

表1 8種中草藥材提取物體外抗肺炎支原體2株流行株MIC結果 （mg.mL-1）

表2 8種中草藥材提取物體外抗肺炎支原體4株耐藥株MIC結果 （mg.mL-1）

2.2 8種中草藥材提取物抗4種肺炎支原體耐藥株實驗結果圖片（備注：因篇幅原因，3.91mg/mL濃度未列出）

3 討 論

肺炎支原體（MP）是呼吸道感染的常見病原，數據顯示，MP是5～15歲兒童社區獲得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）和老年人支氣管肺炎的常見病原菌，占10%～40%［3-4］，僅次于肺炎鏈球菌，且有逐年升高的趨勢。除此之外，它還與急性和慢性呼吸道疾病有關，大約有25%～30%的MP感染會引發肺外并發癥［5］。MP的感染通常間隔3～7年會發生地方性流行和大流行［6-8］。

MP缺乏細胞壁這一結構特點，故對作用于細胞壁的抗生素如青霉素類、頭孢菌素類不敏感，而對影響蛋白質和DNA合成的抗生素如大環內酯類、四環素類、喹諾酮類等敏感?？傮w來說，由于四環素類和喹諾酮類抗生素存在潛在的嚴重不良反應，所以MP感染的治療仍以大環內酯類藥物為主，但近些年來，隨著大環內酯類藥物在臨床上的廣泛應用，臨床遇到越來越多的大環內酯類抗生素治療無效的病例［9］，并分離出耐藥菌株［10］，提示MP耐藥現象的存在。目前，國內外MP耐藥現象嚴重，在世界范圍內呈上升趨勢。據最近幾年資料顯示，MP對大環內酯類耐藥率在日本為30.6%［11］，法國為9.8%［12］，德國為3.0%［13］，美國為27%［14］，我國陳岳明等［15］報道2009年杭州市MP耐藥率達到78.9%，辛德莉等［16］報道2009年北京地區耐藥率已達92%，劉楊等［17］報道2009年上海MP耐藥率為83.0%，韓曉華等［18］報道沈陽地區MP耐藥率達到100%。由此可見，我們國內各地區MP耐大環內酯類非常嚴重。這對肺炎支原體感染導致的肺炎及肺外并發癥的治療產生了極大的挑戰，雖然目前對肺炎支原體耐藥菌株的監測已經被納入美國感染性疾病協會指南以及歐洲呼吸協會指南等，但目前尚無詳細的關于針對肺炎支原體耐藥菌株的治療方案。

由于中藥的特殊性，細菌不易對其產生耐藥，且其具有來源廣，價格低，毒性較低等優點，在防病抗病毒的同時還能提高機體的免疫力，增強機體整體的抗病抗菌能力，從而在MP治療方面漸顯優勢。據鄭青山教授統計研究結果表明，芩柏清肺濃縮丸（主要成分為黃芩，桔梗等）治療支原體肺炎總療效優于阿奇霉素顆粒，與阿奇霉素比較，起效快，改善癥狀明顯［19］。桔梗皂苷D是芩柏清肺丸（芩柏）的重要成分，通過桔梗皂苷D治療肺炎支原體感染的細胞和小鼠，可以使細胞生長加快，同時強烈抑制肺炎支原體P1和P30蛋白的表達，從而抑制肺炎支原體，已被批準為首批有效抗MP的中藥［20-21］。

在對前期中藥治療耐藥性和頑固性支原體肺炎療效回顧性分析時，發現院內制劑復方臭靈丹合劑、清炎合劑、鎮咳神口服液在治療耐藥性MPP上有較好的療效。結合此3種制劑主要成分和臨床用中藥治療耐藥MPP的有效處方方劑，選出本研究用的8種單味中草藥材：臭靈丹、黃芩、魚腥草、南板藍根、桔梗、石斛、半夏、生艾葉；其中石斛、半夏為云南道地特色藥材。這8種藥材具有清熱解毒、潤肺止咳［22］、止咳化痰［23］、抗菌消炎［24］的功效。實驗所選的8種中草藥粗提藥液以及藥液的濃度對2株ATCC15531、ATCC29342肺炎支原體流行株有一定的抑制作用。從實驗結果可以看出，艾葉、桔梗、黃芩、臭靈丹和板藍根對MP的MIC均為3.91mg/mL；魚腥草為15.63mg/mL；石斛為62.5mg/mL；而半夏對MP無抑制作用。對4株肺炎支原體耐藥株，艾葉、桔梗、黃芩、臭靈丹和板藍根對MP的MIC均為15.7mg/mL，魚腥草為31.3mg/mL，石斛為125mg/mL，半夏對MP無抑制作用。8種中草藥對MP流行株和耐藥株的抑制順序相同，依次為：艾葉、桔梗、黃芩、臭靈丹、板藍根抑制作用最強，魚腥草次之，石斛抑制作用較弱，半夏無抑制作用。4株耐藥MP的MIC明顯高于流行標準株。8種中草藥粗提藥液經離心和不離心處理，離心后的藥液對MP的抑制效果有所減弱，尤其是臭靈丹為62.5mg/mL。8種中草藥提取物體外抗人肺炎支原體不離心效果較離心效果好。

目前越來越多的國內外學者開始嘗試從傳統中醫藥中尋找解決細菌耐藥問題的新思路。本研究立足于中藥材，結果表明艾葉、桔梗、黃芩、臭靈丹、板藍根能較好的抑制肺炎支原體流行株及耐藥株，為相關中成藥及院內制劑的研發提供實驗及理論依據。下一步可進一步探討中藥材抑制肺炎支原體的作用機制，以充分發揮檢驗醫學在中西醫結合中的橋梁作用，從而促進中西醫結合事業的發展。