核糖核酸酶A家族成員2基因與膠質瘤免疫浸潤水平及臨床預后的關系分析△

于海明，盧武，李玉姬，張思也

湖南省人民醫院重癥醫學科，長沙 410000

神經膠質瘤是中樞神經系統（central nervous system，CNS）最致命的原發性腦腫瘤。美國約有30%的CNS腫瘤被診斷為神經膠質瘤[1]，其中，惡性腫瘤占81%[2]。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）根據組織學特征將膠質瘤分為Ⅰ～Ⅳ級[3]。彌漫性低級別（WHOⅠ～Ⅱ級）膠質瘤稱為低級別膠質瘤（low-grade glioma，LGG）[4]。由于其增殖速度快和高侵襲性，這些LGG將在幾個月內發展成膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）（WHOⅢ～Ⅳ級）[5]。GBM是最常見的惡性膠質瘤，臨床預后差，很少患者生存時間超過14個月[6]。因此，研發幫助判斷膠質瘤臨床預后的生物標志物是非常必要的。核糖核酸酶A家族成員2（ribonuclease A family member 2，RNASE2）是免疫系統的重要調控因子，是多種腫瘤的預后標志物[7-9]，但其在膠質瘤中與免疫浸潤及預后的關系仍未有研究。本研究通過生物信息學分析RNASE2基因在膠質瘤組織與正常組織中的表達差異，并評估其與膠質瘤預后、免疫浸潤水平的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 RNASE2基因的篩選過程

下載癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atla，TCGA）數據庫中膠質瘤組織測序數據163個和腦組織測序數據44個，進行差異表達基因分析，得到7649個差異表達的基因（P＜0.05）；根據預后數據進行生存分析，取差異最顯著的前500個預后基因（P＜0.05）。免疫基因來自IMMPORT數據庫（https://www.immport.org/shared/genelists）中的細胞因子，共456個。三者采用韋恩在線分析（http://bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn）取交集。

1.2 RNASE2基因的表達水平分析

RNASE2基因在中國膠質瘤基因組圖譜（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）和 TCGA 數據庫泛癌中的表達采用腫瘤免疫評估資源（Tumor Immune Estimation Resource，TIMER）數據庫（http://timer.comp-genomics.org/）和UALCAN數據庫（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）進 行 分 析 。RNASE2基因在TCGA數據庫中膠質瘤組織和腦組織中的mRNA表達量及其與預后的分析均應用基因表達譜動態分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）（http://gepia.cancer-pku.cn/about.html）軟件進行分析。RNASE2基因在CGGA數據庫中GMB和腦組織中的表達量分析采用數據庫自帶軟件（http://www.cgga.org.cn/）進行分析。

1.3 RNASE2與免疫浸潤的關系分析

RNASE2基因表達與大量免疫浸潤細胞的相關性分析應用TIMER2.0數據庫基因模塊進行分析。

1.4 RNASE2及相關基因的京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）及基因本體論（gene ontology，GO）分析

采用Linkedomics軟件（http://www.linkedomics.org/admin.php）中的Pearson相關分析法對TCGA數據庫中膠質瘤（n=489）與RNASE2基因轉錄水平的相關性進行分析，并采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）進行GO功能富集分析及KEGG信號通路分析。

1.5 統計學分析

采用TCGA、CGGA、TIMER、UALCAN、GEPIA、Linkedomics等軟件分析統計數據。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RNASE2基因在膠質瘤中的表達水平

首先將膠質瘤表達差異顯著基因（n=7649）、預后差異顯著基因（n=500）、免疫細胞因子（n=456）取交集，得到7個交集基因，選擇RNASE2作為后續研究對象。采用TIMER分析RNASE2在TCGA數據庫泛癌中的表達，結果顯示RNASE2在膠質瘤中表達較高（P＜0.001）（圖1）。GEPIA分析顯示，RNASE2基因在GMB和LGG中的表達水平均高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。UALCAN分析顯示，RNASE2基因在GMB中的表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.001）（圖3）。

圖1 RNASE2在TCGA數據庫泛癌中的表達

圖2 GEPIA分析RNASE2基因在GMB、LGG及相應癌旁組織中表達水平的比較

圖3 UALCAN分析RNASE2基因在GMB（n=156）及癌旁組織（n=5）中表達水平的比較

2.2 RNASE2表達與臨床特征的關系

CGGA分析顯示，RNASE2基因表達水平在WHOⅡ級、WHOⅢ級、WHOⅣ級膠質瘤中依次遞增，差異有統計學意義（P＜0.001）（圖4）；此外，RNASE2基因在復發膠質瘤中的表達水平明顯高于原位膠質瘤，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖5）。

圖4 CGGA分析RNASE2基因在不同WHO分級膠質瘤中的表達水平比較

圖5 CGGA分析RNASE2基因在復發及原位膠質瘤中的表達水平比較

2.3 RNASE2表達與預后的關系

采用GEPIA2與CGGA分析RNASE2與預后的關系，結果顯示，RNASE2低表達的GMB和LGG患者生存情況均明顯優于RNASE2高表達的GMB和LGG患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（圖6、圖7）

圖6 RNASE2低表達（n=65）與高表達（n=81）GMB患者的生存曲線

圖7 RNASE2低表達（n=257）與高表達（n=257）LGG患者的生存曲線

2.4 RNASE2表達與免疫浸潤的關系

RNASE2mRNA表達水平與CD8+T細胞呈負相關，與調節性T細胞呈正相關（P＜0.05）。（圖8）

圖8 RNASE2 mRNA表達與免疫浸潤的相關性

2.5 RNASE2的基因富集分析

使用Linkedomics的LinkFinder模塊分析TCGA數據庫中膠質瘤患者的mRNA測序數據。結果顯示，6235個基因與RNASE2呈負相關，5807個基因與RNASE2呈正相關。與RNASE2相關的前50位顯著正性基因和前50位顯著負性基因詳見圖9、圖10。RNASE2與免疫基因Toll樣受體1（Toll-like receptor 1，TLR1）呈正相關（r=0.773，P＜0.001）；RNASE2與ARVCFδ連環蛋白家族成員（ARVCFdeltacateninfamilymember，ARVCF）呈負相關（r=-0.471，P＜0.001）。

圖9 與RNASE2相關的前50位顯著正性基因表達熱圖

圖10 與RNASE2相關的前50位顯著負性基因表達熱圖

此外，通過GSEA進行KEGG通路分析，結果顯示，與RNASE2相關的差異表達基因主要富集在免疫（Fc γ介導的吞噬作用）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路等中（圖11）。GO分析結果與KEGG結果類似，RNASE2差異表達基因主要富集在免疫、炎癥[急性炎癥反應、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）生成]相關的生物過程（嗜中性粒細胞介導的免疫）和分子功能（膠原黏附、細胞因子受體活性）。為了進一步研究RNASE2在膠質瘤中可能的分子機制，利用Linkedomics對miRNA進行富集分析，結果顯示RNASE2與（CAGCAGG）miRNA-370相關（圖12）。

圖11 GSEA分析RNASE2差異表達基因KEGG富集通路

圖12 RNASE2的miRNA靶基因分析

3 討論

目前，大多數膠質瘤患者的預后很差，即使采用綜合治療策略。膠質瘤的治療耐藥性已被廣泛報道，與其獨特的代謝機制和周圍復雜的免疫抑制微環境密切相關[10-11]。因此，迫切需要探索可靠的預后生物標志物和個性化治療策略。本研究發現，RNASE2表達在膠質瘤中顯著增加，且與預后、復發有關。RNASE2可作為評價膠質瘤預后與復發的潛在標志物。

RNASE2作為核糖核酸酶A家族的一員，可以作為細胞因子參與免疫及腫瘤的預后[7,12-13]。Ostendorf等[13]的一項研究指出，Toll樣受體8對合成細菌和原生動物RNA的免疫傳感需要RNASET2和RNASE2的協調處理。在胃癌中，RNASE2與預后呈正相關，可作為潛在的評估胃癌預后及免疫浸潤的標志物[7]。RNASE2還被證明為肺動脈高壓及免疫浸潤的標志物[14]。在腎透明細胞癌中，RNASE2與預后相關[15]。在另一項研究中，RNASE2可作為腎透明細胞癌預后的評價指標[9]。上述研究結論進一步佐證了RNASE2作為膠質瘤預后的標志物。

免疫浸潤會導致膠質瘤中免疫微環境破壞，促進免疫逃逸的發生，因此，本研究評估RNASE2水平是否與膠質瘤的免疫浸潤相關。調節性T細胞是CD4+T細胞的一個亞群，在膠質瘤中發揮促進腫瘤免疫逃逸的作用。隨著膠質瘤惡性程度的增加，調節性T細胞比例增加[16]。多項研究說明調節性T細胞的高表達預示不良預后[17-18]。在本研究中，RNASE2基因的表達與調節性T細胞比例呈正相關，RNASE2低表達時，調節性T細胞比例低，預后更好（未提供）。本研究還發現RNASE2的表達與CD8+T細胞呈負相關。CD8+T細胞可分化為細胞毒性T細胞，抵抗外來病原體的入侵[19]。Kane等[20]證明CD8+T細胞介導的免疫編輯抑制小鼠膠質瘤基因組進化和免疫逃逸。

此外，對RNASE2的相關性基因分析發現，RNASE2與ARVCF基因表達呈負相關，與TLR1表達呈正相關。ARVCF表達下調時可抑制p53誘導的腫瘤細胞凋亡[21]。TLR1能夠調節腦腫瘤微環境中的免疫反應[22]。為探討RNASE2影響患者生存的可能機制，本研究對RNASE2差異表達基因進行了GO和KEGG富集分析，結果提示存在多種免疫相關通路。此外，GSEA富集分析進一步揭示了多種免疫相關功能和途徑的富集。因此，推測RNASE2可能通過調節腫瘤免疫發揮促癌作用，如調節性T細胞、CD8+T細胞介導的免疫等，這在之前的研究中沒有發現。

本研究發現了一個新的膠質瘤預后基因RNASE2，它也與免疫密切相關。這一結果在以往國內外研究中未見報道，因此本研究可能會影響膠質瘤未來的診斷和治療。然而，本研究也有一些局限性。本研究未對RNASE2在膠質瘤細胞中的功能和潛在機制進行評估。此外，RNASE2與腫瘤免疫微環境之間的關系仍有待進一步驗證。最后，RNASE2在一些特殊類型的膠質瘤（如彌漫性中線膠質瘤）中的作用仍有待進一步討論。