頂空氣相色譜內(nèi)標(biāo)法快速測(cè)定奶茶中乙醇的含量

歐陽麗，黃 輝，鐘菲菲，楊 韻

（1. 長沙市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 長沙 410013；2. 湖南省市場監(jiān)督管理局缺陷產(chǎn)品召回服務(wù)中心，湖南 長沙 410131）

近幾年奶茶飲品發(fā)展迅速，廣受消費(fèi)者喜愛，由此帶動(dòng)奶茶市場蓬勃發(fā)展，各品牌奶茶店相繼出現(xiàn)，行業(yè)競爭激烈。為吸引更多的消費(fèi)者，近期奶茶行業(yè)悄然興起了混搭新潮流，其中以“酒精+奶茶”風(fēng)頭最盛。多家網(wǎng)紅人氣奶茶店都推出了“酒精奶茶”新飲品。酒精與奶茶混搭雖然新潮但暗含諸多風(fēng)險(xiǎn)。奶茶的定位可能讓部分消費(fèi)者忽視其中含有酒精的事實(shí)，飲后駕駛機(jī)動(dòng)車輛很可能導(dǎo)致酒駕或醉駕，引發(fā)交通事故；酒精過敏者可能因酒精的攝入引起嚴(yán)重的過敏癥狀。尤其對(duì)于未成年人，其作為奶茶消費(fèi)的主要群體，長期飲用“酒精奶茶”會(huì)對(duì)身體造成傷害，甚至導(dǎo)致酒精成癮。

現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了酒、濃縮果汁中乙醇含量的測(cè)定方法[1-2]。酒中乙醇含量測(cè)定時(shí)常用密度瓶法與酒精計(jì)法，這2種方法均不適用于乙醇含量較低的奶茶樣品。雖然“飲料通用分析方法”（GB/T 12143—2008）中規(guī)定該標(biāo)準(zhǔn)只適用于濃縮果汁[2]的測(cè)定，但依據(jù)其測(cè)定原理，奶茶中乙醇含量的測(cè)定也可參照其法。不足之處在于該標(biāo)準(zhǔn)所用方法操作繁瑣，耗時(shí)長，效率低，不利于批量樣品的快速檢測(cè)。食品中乙醇含量檢測(cè)的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較多，主要有密度瓶法[1]、密度計(jì)法[3]、液相色譜法[4-5]、氣相色譜法[6-12]和質(zhì)譜法[13-16]等，但奶茶中乙醇含量的檢測(cè)方法尚未見報(bào)道。

頂空氣相色譜法的原理是將液態(tài)或固態(tài)的待測(cè)樣品（待測(cè)組分在加熱條件下易揮發(fā)）置于密閉頂空瓶或其他密閉系統(tǒng)中，設(shè)定加熱溫度，使樣品中的揮發(fā)性組分揮發(fā)出來進(jìn)入氣相，一定時(shí)間后，頂空瓶或密閉系統(tǒng)中達(dá)到兩相甚至三相平衡，然后將頂空瓶或密閉系統(tǒng)與氣相色譜儀聯(lián)用，收集氣相樣品進(jìn)入氣相色譜進(jìn)行分析檢測(cè)，間接測(cè)定出樣品中待測(cè)組分的含量。該方法檢測(cè)時(shí)無需對(duì)樣品進(jìn)行提取、凈化等處理，操作簡單、快速；加熱平衡時(shí)樣品中的水分、高沸點(diǎn)物或非揮發(fā)性物質(zhì)不揮發(fā)不會(huì)對(duì)色譜柱造成超載和污染，分析結(jié)果靈敏、可靠、準(zhǔn)確。該方法已用于多種基質(zhì)復(fù)雜的樣品中乙醇含量的測(cè)定[6,9,17-18]，尤其適用于乙醇含量低的樣品。內(nèi)標(biāo)法通過測(cè)量內(nèi)標(biāo)物與被測(cè)組分峰面積的相對(duì)值來定量，可以消除因進(jìn)樣量、儀器不穩(wěn)定等操作條件的波動(dòng)對(duì)分析結(jié)果的干擾，是一種準(zhǔn)確度高、精密度好的定量分析方法。基于以上分析，筆者擬采用頂空氣相色譜內(nèi)標(biāo)法分析檢測(cè)奶茶中的乙醇含量，旨在建立一種操作簡單、綠色環(huán)保、準(zhǔn)確方便的奶茶中乙醇含量測(cè)定方法，為食品安全監(jiān)管提供有利的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

主要試劑有乙醇和丙酮（色譜純，默克公司），超純水（一級(jí)）。30批次奶茶樣品購自當(dāng)?shù)啬滩璧昊虺校瑸椴煌昙一蛲坏昙业牟煌町a(chǎn)品。

主要儀器有Agilent 7890A氣相色譜儀[配置氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）和ChemStation工作站]，Agilent 7697A頂空自動(dòng)進(jìn)樣器和20 mL頂空瓶（安捷倫公司，美國），Direct-Q8R默克密理博純水/超純水一體化機(jī)（密理博集團(tuán)，德國），10～100 μL移液器與100～1 000 μL移液器（德國艾本德股份公司，德國）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1樣品的制備及頂空條件優(yōu)化精確量取10.00 mL奶茶樣品于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，向奶茶中迅速加入50 μL色譜純丙酮作為內(nèi)標(biāo)，即內(nèi)標(biāo)含量為0.5%（體積分?jǐn)?shù)，下同），輕微轉(zhuǎn)動(dòng)搖勻后密封，平衡時(shí)保持頂空進(jìn)樣瓶直立，不振蕩。試驗(yàn)研究了不同平衡溫度（55、60、65、70、75、80℃）和平衡時(shí)間（5、10、15、20、25、30、35 min）對(duì)奶茶樣品中乙醇、丙酮響應(yīng)值的影響，得出最優(yōu)的頂空條件。其他頂空條件參數(shù)為：GC循環(huán)時(shí)間30 min，閥溫110℃，壓力平衡時(shí)間1.0 min，傳輸線溫度115℃，進(jìn)樣時(shí)間0.04 min。

1.2.2色譜條件優(yōu)化乙醇是極性分子，根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)[9]，選擇極性毛細(xì)管色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行分離分析，以保證分離效果好、干擾組分少。該研究選用的SH-Rtx-Wax毛細(xì)管柱規(guī)格為30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm。該試驗(yàn)重點(diǎn)優(yōu)化了升溫程序，設(shè)置了柱溫恒定為170℃和程序升溫2種處理，還對(duì)程序升溫的初始溫度、升溫速率、終止溫度等參數(shù)進(jìn)行了不斷優(yōu)化。其他色譜條件參數(shù)為：進(jìn)樣口溫度200℃，F(xiàn)ID溫度230℃；載氣為氮?dú)猓魉? mL/min；氫氣流速25 mL/min；空氣流速300 mL/min；分流比1∶1；尾吹氣為氮?dú)猓魉贋?0 mL/min；進(jìn)樣量為100 μL。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精確量取9份10.00 mL蒸餾水分別放入20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，向每份蒸餾水中迅速加入50 μL色譜純丙酮作為內(nèi)標(biāo)，即內(nèi)標(biāo)含量0.5%，用手輕微搖勻后，再用移液器迅速加入0、10、20、50、100、200、500、800和1 000 μL色譜純乙醇，密封。保持頂空瓶直立，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)瓶身，使物質(zhì)充分混合，將乙醇配制成濃度分別為0%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、8.0%和10.0%的含0.5%丙酮內(nèi)標(biāo)的待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中乙醇濃度為0%的溶液為標(biāo)準(zhǔn)空白溶液。注意：轉(zhuǎn)動(dòng)過程中液體不能接觸到密封墊。

1.2.4基質(zhì)效應(yīng)取3份乙醇空白的奶茶樣品，向每份樣品中迅速加入50 μL丙酮作為內(nèi)標(biāo)，用手輕微搖勻后，再用移液器迅速加入20、50和500 μL乙醇，制成乙醇濃度為0.2%、0.5%和5.0%的空白基質(zhì)配標(biāo)溶液，每個(gè)濃度重復(fù)6次（n=6），相同濃度標(biāo)液中乙醇與丙酮峰面積比的平均值記為A。同時(shí)配制濃度為0.2%、0.5%和5.0%的純?nèi)軇ㄈ軇樗?biāo)準(zhǔn)溶液，相同濃度標(biāo)液中乙醇與丙酮峰面積比的平均值記為B。以A/B值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。

1.2.5方法學(xué)驗(yàn)證（1）檢出限與定量限。經(jīng)空白奶茶加標(biāo)試驗(yàn)，以信噪比（S/N）為3計(jì)算方法的檢出限（LOD），以信噪比（S/N）為10計(jì)算方法的定量限（LOQ）。（2）加標(biāo)回收率與精密度。在空白奶茶基質(zhì)中加入50 μL色譜純丙酮后，再分別添加20、50和500 μL乙醇，每個(gè)添加水平平行6次，考察檢測(cè)方法的回收率與精密度。（3）日間精密度。配制3批加標(biāo)水平均為0.2%的樣品，室溫下分別放置0、1、2和3 d進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)乙醇與丙酮峰面積比值的變化評(píng)價(jià)該方法的日間精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的最佳升溫程序

奶茶成分復(fù)雜，其中的揮發(fā)性組分可能干擾乙醇、丙酮在色譜柱上的分離效果，因此色譜柱柱溫的設(shè)置非常關(guān)鍵。該試驗(yàn)首先將柱溫恒定為170℃，在該條件下乙醇、丙酮的色譜峰不能達(dá)到基線分離，且出峰時(shí)間太早，可能存在雜峰干擾。隨后將柱溫改為程序升溫，通過對(duì)初始溫度、升溫速率、終止溫度等參數(shù)的不斷優(yōu)化，得到最佳的升溫程序?yàn)椋?0℃保持2 min，以10℃/min升至170℃，再以20℃/min的速度升至220℃，保持3 min。按照該升溫程序獲得了保留時(shí)間適宜、分離度高，干擾小的色譜峰，如圖1所示。

圖1 奶茶樣品中丙酮和乙醇的頂空氣相色譜圖

2.2 樣品的最佳平衡溫度

根據(jù)測(cè)定原理，平衡溫度是影響檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵因素之一，樣品平衡溫度在一定范圍內(nèi)越高，被測(cè)組分在頂空體系中分配系數(shù)越小，在頂空瓶氣相中的濃度越高；但溫度越高，頂空瓶中氣體壓力越大，對(duì)加壓取樣要求更高，且過高的溫度下某些物質(zhì)會(huì)發(fā)生分解和氧化。從圖2可知，平衡溫度越高，乙醇、丙酮的峰面積越大；當(dāng)溫度升高到75℃后，乙醇峰面積隨溫度升高而增大的趨勢(shì)不再明顯。因此，該試驗(yàn)將平衡溫度選擇為75℃。

圖2 平衡溫度對(duì)乙醇、丙酮峰面積的影響

2.3 樣品的最佳平衡時(shí)間

樣品平衡時(shí)間也是影響檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵因素。在一定溫度條件下，奶茶樣品中的乙醇在氣-液兩相或氣-液-固三相中達(dá)到分配平衡需要一定的時(shí)間。時(shí)間太短，乙醇揮發(fā)不完全；時(shí)間過長，其他揮發(fā)性物質(zhì)的干擾增大，且影響分析效率。該試驗(yàn)考察了不同平衡時(shí)間條件下，乙醇、丙酮色譜峰響應(yīng)值的變化。結(jié)果表明：當(dāng)平衡時(shí)間達(dá)到15 min后，丙酮的峰面積幾乎不再改變；當(dāng)平衡時(shí)間達(dá)到30 min后，乙醇的峰面積幾乎不隨平衡時(shí)間的增加而增大。因此，后續(xù)試驗(yàn)將平衡時(shí)間設(shè)定為30 min。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)是指樣品中除待測(cè)組分外的物質(zhì)。基質(zhì)常常會(huì)在化學(xué)分析過程中對(duì)待測(cè)組分分析結(jié)果的準(zhǔn)確性造成干擾與影響，這種干擾與影響稱為基質(zhì)效應(yīng)（ME）。基質(zhì)效應(yīng)是一種評(píng)價(jià)檢驗(yàn)方法的有效手段。一般情況下，ME值在85%～115%范圍內(nèi)表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯[19]。頂空分析中，待測(cè)組分測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性既與本身的揮發(fā)性有關(guān)，又與樣品基質(zhì)有關(guān)，特別是在樣品基質(zhì)中溶解度大的組分，基質(zhì)效應(yīng)更為明顯[20]。通過計(jì)算，乙醇濃度為0.2%、0.5%和5.0%時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)分別為98.52%、100.23%和100.11%，這表明基質(zhì)的存在對(duì)乙醇的測(cè)定不產(chǎn)生干擾。因此，頂空氣相色譜內(nèi)標(biāo)法中標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制無需采用基質(zhì)配標(biāo)。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1方法的線性與檢出限將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于儀器分析條件下上機(jī)分析后，以保留時(shí)間定性，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中乙醇與丙酮濃度比為橫坐標(biāo)，乙醇峰面積與丙酮峰面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。其線性方程為：y=0.282 5x-0.039 4，R2=0.998 3，表明乙醇在0.1%～10.0%l濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。頂空內(nèi)標(biāo)氣相色譜法中乙醇的LOD與LOQ分別為0.04%與0.1%，方法靈敏度較高。

2.5.2加標(biāo)回收率與精密度從表1可知，乙醇回收率在93.98%～105.31%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.34%～6.15%之間，表明3個(gè)加標(biāo)濃度水平的回收率高，結(jié)果重現(xiàn)性好。加標(biāo)濃度為0.2%的樣品分別放置0、1、2和3 d測(cè)定含量的RSD值為6.42%，表明樣品在放置3 d后精密度良好。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用優(yōu)化后的檢測(cè)方法對(duì)市售的30批次奶茶樣品進(jìn)行乙醇含量檢測(cè)，其中6批次樣品檢出乙醇，乙醇含量分別為0.36%、0.63%、1.85%、2.02%、2.27%和2.35%。依據(jù)GB/T 17204—2008飲料酒分類標(biāo)準(zhǔn)，酒精（乙醇）含量大于0.5%的飲料與飲品均為酒精飲料[21]。所收集的奶茶樣品中有16.7%的樣品乙醇含量已超過0.5%，按照分類已屬于酒精飲料，應(yīng)該引起相關(guān)職能部門的高度重視。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)GB/T 12143—2008飲料通用分析方法，常用于測(cè)定濃縮果汁中乙醇含量的方法為氧化還原滴定法，氧化還原滴定法需將樣品中乙醇蒸餾出來，在酸性、恒溫水浴條件下用重鉻酸鉀氧化后，再用硫酸亞鐵銨溶液反滴定，根據(jù)重鉻酸鉀的加入量和硫酸亞鐵銨的消耗量計(jì)算樣品中乙醇的含量。與之相比，頂空氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定奶茶中的乙醇時(shí)不需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，儀器自動(dòng)化程度高，分析速度快，結(jié)果準(zhǔn)確，適合批量樣品快速測(cè)定（平均每個(gè)樣品檢測(cè)耗時(shí)小于40 min）。氧化還原滴定法需配置重鉻酸鉀、硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，酸堿指示液與氧化還原指示液等各種試劑，且需將乙醇從樣品中蒸餾出來，恒溫水浴1 h后，再進(jìn)行氧化還原滴定，步驟操作繁瑣，耗時(shí)較長（平均每個(gè)樣品檢測(cè)耗時(shí)約3 h），相比之下頂空氣相色譜內(nèi)標(biāo)法在檢測(cè)效率與操作方式方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

通過對(duì)頂空條件與氣相色譜條件的優(yōu)化，建立了氣相色譜頂空內(nèi)標(biāo)法測(cè)定奶茶中乙醇含量的方法，并考察了其方法學(xué)指標(biāo)。該方法在0.1% ～10%濃度范圍內(nèi)線性良好（R2＞0.998）；靈敏度高，當(dāng)取樣量為10.00 mL時(shí)，該方法檢出限為0.04%；通過對(duì)樣品的加標(biāo)回收和樣品中目標(biāo)物質(zhì)的反復(fù)多次驗(yàn)證，測(cè)試結(jié)果表明，該方法精密度和準(zhǔn)確度高，樣品中加標(biāo)回收率達(dá)93.98%～105.31%。頂空氣相色譜內(nèi)標(biāo)法不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，操作簡單，耗時(shí)短，且儀器自動(dòng)化處理，檢測(cè)效率高，內(nèi)標(biāo)的加入又很好地解決了頂空法樣品分析重現(xiàn)性差的不足，提高了分析的準(zhǔn)確性，適用于在實(shí)驗(yàn)室快速批量檢測(cè)奶茶樣品中乙醇的含量，為市場監(jiān)管部門規(guī)范奶茶中添加酒精的亂象提供了一種有力的技術(shù)支撐。