一株共青土壤產堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌的分離純化與鑒定

江 強，占夢婷，朱 鵬，程夢琴，余 超，郭建業，陳柳萌，李 敏*

（1.南昌大學 科學技術學院 理工學科部 生物化學系，江西 九江 332020；2.江西省農業科學院 微生物研究所，江西 南昌 330200）

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是一種常見的革蘭氏陽性嗜熱細菌，廣泛分布于土壤中，與植物微生態聯系密切，可分泌活性較強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，其中堿性蛋白酶水解蛋白的能力更強［1-2］。在惡劣環境條件下，能夠產生孢子抵御不良條件的影響，對不同環境具有很強的適應性，且易于保存。地衣芽孢桿菌具有非常大的工業應用潛力，目前已成為重要的工業生產菌種。其活性菌被廣泛應用于飼料添加劑來促進動物的消化吸收，從而利于其生長。同時還被用于制備成生物制劑，通過其生物奪氧機制抑制致病菌的生長并且可產生多種抗菌物質，以膠囊等形式治療動物及人體腸道菌群失調，提高人體免疫力［1，3，4］。另外，地衣芽孢桿菌能夠產生多種抗生素［2］，且對動植物無毒無害、不殘留且對病原菌不易產生耐藥性［1，5］，具有制備不耐藥型抗生素的潛力。地衣芽孢桿菌還被證實對養殖的水質具有凈化作用［6］。

堿性蛋白酶（Alkaline protease）是一類可在堿性環境下將蛋白質水解成多肽和氨基酸的蛋白酶，最適反應的pH值范圍在9～11之間［7］。堿性蛋白酶是一種非常重要的工業酶，廣泛應用于食品、制藥、皮革和洗滌劑的工業生產中［8］。與植物和動物相比，微生物是一種有吸引力的蛋白酶來源，可通過現有的發酵方法在相對較短的時間內大量培養并產生大量穩定的生物活性產品。此外，微生物的蛋白質更加穩定，可在低于理想環境下儲存數周，貨架期更長［9］。堿性蛋白酶主要來源于地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和小芽孢桿菌等。國內外學者對產堿性蛋白酶的芽孢桿菌進行了篩選和發酵條件的研究。舒丹等［10］從西藏尼木卡如林溫泉土壤中分離得到一產堿性蛋白酶芽孢桿菌，具有良好的pH值穩定性和熱穩定性，并顯示出與去污劑有良好的相容性。黃繼翔［11］從土壤中篩選出一株高產蛋白酶菌株Bacillus sp.HFBL0079，該菌株產生的堿性蛋白酶可水解多種天然蛋白質，并對膠原蛋白和羽毛蛋白有較高的水解度。

目前利用微生物發酵生產蛋白酶已經成為工業發酵的熱點。隨著微生物在工業發酵中的作用越來越大，吸引了許多國內外研究者對微生物發酵產蛋白酶工藝的研究，但一般從自然界中篩選出來的野生菌株產酶能力較弱，遠不能達到工業生產的需求。因此，有大量的研究者通過對菌株進行誘變或改變菌株的發酵條件從而達到增加產酶量的效果。候澤林［12］從腐植質較多的土壤中篩選出一株酶活為260.7 U/mL的解淀粉芽孢桿菌T-18，誘變后的酶活達到了2337 U/mL，在此基礎上進一步對培養條件進行了優化，優化后的酶活高達1229 U/mL。徐子淵等［13］誘變原產堿性蛋白酶菌株2709，所獲得變異株C1213酶產量較之原菌株提高了40%。周桂旭［14］利用定點突變的技術分別對堿性蛋白酶基因的188位、239位、262位氨基酸殘基進行基因定點突變，構建了4個突變體，其酶活力相對野生型均有不同程度的提高，其中最高較原菌株提高了3.3倍。同時，突變后的菌株在催化效果和熱穩定性上也有明顯的提升。另外，周魏等［15］通過優化培養基組分比例、pH值、培養溫度、接種量等條件有效提高了地衣芽孢桿菌產堿性蛋白酶的能力，優化后的菌株產酶酶活比之前提高了8.04倍。

本研究從共青地區的土壤中篩選分離得到產堿性蛋白酶活性較高的地衣芽孢桿菌，為后續在環境綠色友好型發展方面的相關研究及應用提供了物質基礎，同時也為后續對地衣芽孢桿菌進行定向誘變，以滿足特殊工業化生產提供了物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤來源 2021年9月20日，采樣自江西省九江市共青城市的禽類養殖地土壤，于實驗室4℃保存，并進行土壤處理及菌株篩選。具體詳情如表1所示。

表1 土樣采集信息

1.1.2 試劑 酪素/酪蛋白，購自國藥集團化學試劑有限公司；MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 及MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒，均購TAKARA公司；酪氨酸標準品及福林酚試劑，均購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 儀器與設備 SW-CJ-1D型單人單面垂直凈化工作臺（蘇州智凈凈化設備有限公司）；RePure-A型基因擴增儀（杭州柏恒科技有限公司）；DYY-8C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；WD-9413B 型凝膠成像分析儀（北京市六一儀器廠）；MDF-382E（N）型超低溫冰箱，（SANYO）；B203LEDR型生物光學顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司）等。

1.1.4 培養基的配制 初篩培養基（g/L）：葡萄糖0.5、酪素10.0、NaCl 5.0、K2HPO40.5、K2HPO40.5、瓊脂20.0。pH值調至7.2～7.4，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發酵培養基（g/L）：酵母粉 5.0、蛋白胨10.0、NaCl 15.0、瓊脂 15.0。pH 值調至7.3～7.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，斜面保藏培養基需另加入瓊脂15 g/L，擺成斜面備用。

牛肉膏蛋白胨培養基（g/L）：牛肉膏3.0、蛋白胨1.0、NaCl 5.0。pH值調至7.0～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，固體培養基需另加入瓊脂15～20 g/L。

糖發酵培養基（g/L）：（NH4）2HPO41.0、KCl 0.2、MgSO40.2、酵母膏0.2、糖類（乳糖/麥芽糖/蔗糖/葡萄糖/阿拉伯糖/甘露醇）。使各成分溶解于水后，調整pH值為7.2～7.4，加入指示劑1.6%指示劑溴甲酚紫15 mL，定容后使滅菌后培養基pH值在25 ℃時為7.0±0.2，分裝試管，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

檸檬酸鹽培養基（g/L）：NaCl 5.0、MgSO4·7H2O 0.2、（NH4）H2PO41.0、K2HPO41.0、C6H5Na3O75.0、瓊脂15.0。使各成分溶解于水后，調整pH值為7.2～7.4，加入指示劑1%溴麝香草酚藍溶液10 mL，定容后使滅菌后培養基pH值在25 ℃時為7.0±0.2，分裝試管，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后，擺成斜面備用。

明膠培養基（g/L）：牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、明膠120.0。調整pH值為7.0～7.2，定容后分裝于試管，121 ℃滅菌20 min。

丙酸鹽培養基（g/L）：NaCl 5.0、MgSO4·7H2O 0.2、（NH4）H2PO41.0、K2HPO41.0、CH3CH2COONa 2.0、瓊脂15.0。各成分溶解于水后，調整pH值為7.2～7.4，加入指示劑1%溴百里酚藍（溴麝香草酚藍）水溶液10 mL，定容使滅菌后培養基pH值在25℃時為7.0±0.2，分裝試管，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后，擺成斜面備用。

培養基的配制均使用去離子水。

1.2 方法

1.2.1 產堿性蛋白酶菌株的分離篩選 菌株初篩。稱取10 g土樣加入90 mL的無菌水（含20 mL玻璃珠）中，180 r/min振蕩混勻，90 ℃水浴1 h，放置室溫冷卻沉淀。取1 mL土壤上層懸液，加入裝有9 mL的無菌水的試管中混勻，并按10倍梯度稀釋至10-7。分別取10-5、10-6、10-73種濃度的菌液200 μL涂布于初篩培養基，37 ℃培養48 h。

菌株進一步分離純化。挑取周圍有水解圈的菌落進行平板劃線，37 ℃培養后，挑取有水解圈的菌落繼續平板劃線，直至獲得單一菌株。

1.2.2 產堿性蛋白酶地衣芽孢桿菌的篩選與鑒定（1）形態學篩選鑒定。參照《常見細菌系統鑒定手冊》［16］和《伯杰氏細菌鑒定手冊》［17］中地衣芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，可產生中生孢子的形態學特征，將獲得的菌株進行革蘭氏染色和孔雀石綠芽孢染色進一步篩選。

（2）生理生化篩選鑒定。根據《GB/T 26428—2010飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》［10］、《常見細菌系統鑒定手冊》［16］和《伯杰氏細菌鑒定手冊》［17］，利用糖發酵實驗（乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和阿拉伯糖，甘露醇）、明膠水解實驗、7%氯化鈉生長實驗、丙酸鹽實驗、檸檬酸鹽實驗、3%過氧化氫接觸酶實驗等對菌株進一步篩選。

（3）分子生物學篩選鑒定。使用TaKaRa公司的MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取目標菌株的基因組DNA，經20倍稀釋后作為模板，以27F和1541R引物進行PCR擴增反應獲得菌株16S rDNA基因片段。16S rDNA序列擴增引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列［18］如下：正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，Tm=60 ℃；反向引物1541 R：5’-AAGGAGGTATCCACCC-3’，Tm=50 ℃。

PCR反應體系為25 μL：上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，Taq（5 U/μL）0.2 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L/each）2.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 17.3 μL。

PCR反應程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 cycles；95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 cycles；95 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 cycles；95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 cycles；95 ℃ 1 min，50℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 cycles；72 ℃ 5 min ；95 ℃1 min，48 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，15 cycles；72 ℃ 5 min；4 ℃恒溫。

將基因片段用TaKaRa公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒回收，并送上海生物工程有限公司測序。測序結果通過美國國家生物技術信息中心（NCBI）的BLAST程序檢索比對并用MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining模型構建系統進化樹。

1.2.3 堿性蛋白酶粗酶液的制備及酶活力測定 參考GB/T 23527—2009標準中的福林酚試劑測定法對堿性蛋白酶酶活的測定［19］。一個酶活單位的定義：在40 ℃，pH值為10.5的條件下1 mL酶液水解酪蛋白1 min產生1 pg酪氨酸所需要的酶量，酶活力單位為U/mL。

以酪蛋白作為底物，采用Folin-酚試劑法測定酶活。1 g酪蛋白溶于100 mL硼酸緩沖液調節pH值為10.5制備酪蛋白溶液（10 g/L）。發酵液經10000 r/min離心后取上清，1 mL上清液與1 mL酪蛋白溶液混勻40 ℃水浴保溫10 min，加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸混勻終止反應，10000 r/min離心2 min，取濾液1.00 mL 加碳酸鈉溶液5.00 mL，加1∶1福林酚試劑1 mL，在40 ℃水浴保溫顯色20 min，于波長680 nm下，置于10 mm比色皿測定吸光值。

2 結果與分析

2.1 獲得單一菌株的形態特征

通過對取得土樣制備孢子懸液，并進行梯度稀釋涂布于初篩培養基，將能夠產生水解圈的菌落進一步通過平板劃線進行菌落分離，最終獲得能夠分解利用初篩培養基中的酪蛋白的單一菌落。其中菌株2-1-1在初篩培養基上的菌落形態如圖1所示，可觀察到菌落呈米白色，且菌落上有圓環狀突起，周圍略呈半透明狀，表面光滑。

圖1 菌株2-1-1菌落圖

2.2 形態學觀察確定獲得地衣芽孢桿菌

根據《常見細菌系統鑒定手冊》［16］和《伯菌鑒定手冊》［17］中可知地衣芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，還可產生中生孢子。故將獲得的菌株進行革蘭氏染色和孔雀石綠芽孢染色進一步篩選，結果如表1所示。

表1 形態學特征實驗結果

其中菌落2-1-1的革蘭氏染色圖結果如圖2A所示，可觀察到菌株革蘭氏染色為桿狀，且菌體呈紫色，說明菌株為革蘭氏陽性菌；孔雀石綠染色結果如圖2B所示，可觀察到菌體染色為紫紅色，且菌體中間有綠色，說明菌株可產生芽孢，且為中生芽孢。故該菌株符合地衣芽孢桿菌的形態學特征。

圖2 菌株2-1-1的染色圖（×100）

2.3 生理生化實驗篩選確定獲得地衣芽孢桿菌

根據《常見細菌鑒定手冊》［16］和《伯杰氏細菌鑒定手冊》［17］中芽孢桿菌屬特性對獲得的4株菌株進行鑒定，并以生化系實驗室中的枯草芽孢桿菌作為對照組，其結果見表2。生理生化實驗性狀為：接觸酶、7%氯化鈉生長、明膠水解均呈陽性；檸檬酸鹽及丙酸鹽利用實驗均呈陽性；可利用葡萄糖產氣及常見糖類如L-阿拉伯糖、D-甘露糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖產酸。

表2 生理生化特征實驗現象

2.4 16S rDNA基因序列及系統發育分析

從以上實驗中符合預期的菌株進行基因組抽提，通過1%瓊脂糖凝膠電泳驗證其基因組DNA大小，預期其大小約為23 kb。結果顯示4株菌基因組條帶大小均在9416～23130 bp之間（圖3），與預期結果相符。

圖3 各菌株基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

以稀釋20倍的各菌株基因組為模板，進行PCR擴增反應獲得菌株16S rDNA，再通過1%瓊脂糖凝膠電泳驗證其16S rDNA大小，預期其大小約為1.5 kb。結果顯示4株菌16S rDNA條帶大小均在1 kb和2 kb之間（圖4），與預期結果相符。

圖4 各菌株16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖

將與預期結果相符的菌株16S rDNA擴增片段用TaKaRa 公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒進行片段回收，并送上海生物工程有限公司測序。將測序結果通過美國國家生物技術信息中心（NCBI）的 BLAST程序進行檢索比對，同時還利用MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining模型構建出4株菌株的系統發育樹如圖5-8。結果顯示：菌株2-1-1與地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformisWSR-KSU302親緣關系最近（97.24%），在構建的系統發育樹中自然類聚（圖5）；菌株2-1-2與地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformisSUM-KSU304親緣關系最近（97.90%），在構建的系統發育樹中自然類聚（圖6）；菌株2-1-3與地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformisWSR-KSU302親緣關系最近（97.37%），在構建的系統發育樹中自然類聚（圖7）；菌株3-1-1與地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformisstrain SIITMB5親緣關系最近（97.23%），在構建的系統發育樹中自然類聚（圖8）。說明篩選獲得的4株菌均為地衣芽孢桿菌。

圖5 菌株2-1-1系統發育進化樹

圖6 菌株2-1-2系統發育進化樹

圖7 菌株2-1-3系統發育進化樹

圖8 菌株2-1-1系統發育進化樹

2.5 4株地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶活力測定結果

如圖9是在OD680nm處測定吸光度，以光密度A作為y軸，酪氨酸含量（微克數）作為x軸，繪制的標準曲線。酪氨酸標準曲線的線性回歸方程為：y=0.0115x-0.0087，相關系數R2=0.9985，K值在吸光值為1時酪氨酸的濃度，經計算可得K=87.713。

圖9 酪氨酸標準曲線

在100 mL的液體發酵培養基中接入1%的菌液，37 ℃于220 r/min搖床培養，48 h過夜發酵培養。發酵液10000 r/min離心取上清，測定并計算其粗酶液堿性蛋白酶活力。同時，將4株地衣芽孢桿菌在37 ℃恒溫培養箱中培養48 h后，用游標卡尺測量其水解圈直徑（H）和菌落直徑（C），并計算它們的H/C的比值。4株菌在酪蛋白培養基上生長時產生的水解圈情況和搖瓶培養各菌株發酵液中堿性蛋白酶的酶活情況如表3所示。結果顯示4株菌中2-1-1菌株的直徑比最大為3.96；同時其酶活也最高達805.53 U/mL。

表3 菌株水解圈情況及對應產堿性蛋白酶活情況

3 結果與討論

本文從江西九江共青城市兩處禽類養殖地土壤中共篩選出4株產堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌。通過酪蛋白培養基的初篩，結合形態學鑒定、生化鑒定和分子學鑒定，確定4株細菌皆為地衣芽孢桿菌，并分別命名為菌株2-1-1、菌株2-1-2、菌株2-1-3和菌株3-1-1。利用Folin-酚試劑法測定4株菌株堿性蛋白酶的酶活，經測定，菌株2-1-1的酶活力最高，可達805.53 U/mL，其他3株菌株的酶活依次為688.87 U/mL、593.91 U/mL和729.40 U/mL。

本文立足于共青地區羽絨加工制造的特色支柱產業，依托共青地區廣泛分布的禽類養殖場所和大型羽絨服制造廠，為前期研究工作提供了豐富的土壤資源。后續工作可圍繞菌株誘變育種和完善培養條件來提高其產酶能力、堿性蛋白酶的純化及酶學性質等方面深入探索，為工業化應用奠定基礎，有助于開發共青地區具有獨特優勢的土壤生物資源。另外，本文利用堿性蛋白酶粗酶液測得堿性蛋白酶酶活，且酶活力較高，經分析該粗酶液為混合酶液，由于實驗室條件及經費的限制，我們目前無法得知所篩選獲得的地衣芽孢桿菌產堿性蛋白酶的種類組成，分析其酶類組成，可能探索出目前尚未發現的新型高活力堿性蛋白酶并為后續探究該新型酶在實際應用上的潛在功能奠定了基礎。