中藥渣有機肥+化肥對設施番茄和土壤細菌多樣性的影響

劉曉梅，蘇文英，紀 偉，王光飛，郭德杰，馬 艷，任立凱*

（1.連云港市農業科學院，江蘇 連云港 222000；2.江蘇省農業科學院 資源與環境研究所,江蘇 南京 210014）

隨著我國農業結構的調整，設施蔬菜的種植面積逐年增加，并在我國農業生產中占據著重要地位。然而，在種植過程中，農戶為了追求高產，農藥和化肥的不合理使用導致土壤酸化、次生鹽漬化、土傳病害、水環境污染等問題日漸突出［1-2］。蘇北設施蔬菜以產值高的茄果類蔬菜為主，其種植面積占江蘇65%以上［3］。茄果類蔬菜因采收期長、產量大，盲目、過量施用畜禽類農家肥和化肥的現象更為突出，導致土壤養分過剩、理化性狀惡化、整體質量下降［4］。設施蔬菜土壤質量的退化和生態環境的惡化不僅影響了蔬菜的生長，造成減產減收，而且嚴重威脅到食品安全和人類健康。因此，在設施蔬菜種植過程中，如何均衡合理配施有機無機肥料已成為當前研究的熱點。大量研究表明，均衡合理配施有機無機肥料，不僅有利于促進土壤碳、氮轉化、提升土壤肥力可持續性，而且能夠提高和改善作物的產量與品質，減少作物發病率，改善土壤理化性狀，增加土壤微生物多樣性等［5-10］。

據統計，我國中藥渣的年排放量達6000萬～7000萬t［11］。中藥渣作為一種有機廢棄物目前尚無大規模利用的有效途徑，一般是作為廢棄物，多采用簡單粗放的手段堆放、填埋或焚燒處理，不僅造成了資源浪費，也極易對周圍環境造成污染［12-13］。中藥渣營養成分豐富，富含纖維、多糖、蛋白以及微量元素等營養成分，重金屬含量低且不含病原菌和抗生素，質輕、通氣性好，是一種優質的有機肥原料［14-15］，將中藥渣發酵成為有機肥，應用到農業栽培中進行改土培肥是實現中藥渣資源化利用的有效方式之一［16-19］。

土壤微生物作為土壤生態鏈中的關鍵組成部分，直接參與土壤結構的形成，推動著土壤養分的循環和能量流動，在維持土壤生態功能中扮演著重要角色［20］，其中細菌在土壤微生物數量中占有絕對優勢，決定著土壤微生物總量的分布，影響著有機物的分解和轉化［21］。設施蔬菜種植過程中土壤微生物多樣性、群落組成和結構的變化可以作為土壤受損程度和質量變化的重要預警指標，理解土壤微生物及功能群的變化對揭示設施蔬菜栽培條件引起的土壤質量退化微生物學機制及保持設施土壤可持續性具有重要意義。

目前，對于中藥渣有機肥的應用研究主要在于提高作物產量和改善品質等方面［22-23］。本試驗探究了中藥渣有機肥在與不同用量化肥的協同作用下，設施番茄的生長狀況，并利用高通量測序技術，分析不同處理下土壤微生物多樣性、群落組成和結構的差異，并揭示影響作物生長的關鍵土壤環境因素，闡明土壤微生物群落對設施生產條件變化的響應規律，為中藥渣有機肥與化肥的科學合理化配施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況和供試材料

試驗在江蘇省連云港市農業科學院東辛試驗基地塑料大棚中進行。供試土壤基本理化性狀為：pH值7.8、有機質含量22.32 g/kg、全氮2.0 g/kg、全磷1.7 g/kg、全鉀15.7 g/kg。供試作物番茄為粉果，由淮安市農業科學研究院提供。供試化肥為金正大復合肥（15-15-15）、硫酸鉀（K2O ≥52%）、磷酸二銨（N 18%、P2O546%）。中藥渣有機肥由江蘇好徠斯肥業有限公司提供，中藥渣有機肥含有機質≥45%、N 1.78%、P2O50.92%、K2O 2.63%、水分含量40%。含微量元素的高鉀水溶肥（順欣15-15-30-TE）。

1.2 試驗設計

試驗共設4個處理。CMR60處理組施用3500 kg/667 m2中藥渣有機肥+60 kg/667 m2NPK化肥、CMR70處理組施用3500 kg/667 m2中藥渣有機肥+70 kg/667 m2NPK化肥、CMR80處理組施用3500 kg/667 m2中藥渣有機肥+80 kg/667 m2NPK化肥、CMR90處理組施用3500 kg/667 m2中藥渣有機肥+90 kg/667 m2NPK化肥，各處理肥料施用量見表1。每個處理4次重復，共16個小區，每小區面積為12.6 m2，每個小區種植3壟，每壟2行，每行8棵（行間距35 cm，株距30 cm），完全隨機區組設計。中藥渣有機肥作為基肥一次性施入，化肥基追肥的比例為1∶1.6。4月26日左右移栽，坐果后，每隔10～12 d沖施10 kg/667 m2高鉀水溶肥（15-15-30-TE），整個生長期共追肥7次，各處理用量一致。

表1 不同處理中藥渣有機肥和化肥的用量 kg/667 m2

1.3 土壤樣品的采集與分析

土壤樣品采集時間為2019年7月19日，用環刀取0～10 cm土層土壤樣品測定其物理性質。另外，采集各處理耕層（0～20 cm）土壤樣品，每小區多點混合采樣，去除植物根系和石塊，采用四分法分為2份：1份自然風干過篩用于測定土壤化學性質；1份裝入無菌袋中帶回實驗室，-80 ℃冰箱保存用于微生物DNA的提取，各處理編號與采集土樣編號一致。

1.4 番茄各項指標的測定

番茄植株生長指標、產量及品質的測定：定植后每隔30 d測定植株的株高、莖粗、葉綠素，共測定4次。于采收期測定植株產量，并測定果實的可溶性固形物和可滴定酸的含量。株高是番茄植株子葉到生長點的高度，用卷尺測量；莖粗是生長點以下第6～7片真葉間的莖的直徑（移栽后第1次測量子葉與第1片真葉間的莖的直徑）；葉綠素采用葉綠素測定儀測量；可溶性固形物采用手持糖度計測定；可滴定酸采用酸堿滴定法測定。

土壤理化性質測定：土壤pH值采用pH計測定（土水比1∶2.5）；有機質含量采用重鉻酸鉀滴定法測定；全氮（TON）采用凱氏定氮儀進行測定；全磷含量采用鉬銻抗比色法測定；全鉀采用火焰光度法測定［24］；土壤細菌群落分析由上海派森諾生物科技股份有限公司（上海）完成，采用Illumina MiSeq平臺對細菌群落DNA片段進行雙端（Paired-end）測序。

1.5 統計分析方法

采用QIIME進行土壤細菌群落相關指標分析；采用Excel 2012軟件制圖；采用SAS 9.0軟件對番茄各農藝性狀及土壤基本屬性進行顯著性分析；采用歐易生物云對土壤菌群結構與環境因子進行冗余分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

從表2可以看出，不同施肥處理后土壤有機質含量存在顯著差異，含量由高到低依次是CMR80＞CMR90＞CMR60＞CMR70。CMR80處理組的土壤全氮含量最高，其次是CMR60處理組，均顯著高于CMR70、CMR90處理組。CMR80處理組的土壤全磷含量顯著低于其他處理組，且其他處理組之間無顯著差異；CMR80處理組土壤全鉀含量顯著低于CMR90處理組，其他處理組之間無顯著差異。各處理組土壤pH值無顯著差異。

表2 中藥渣有機肥配施化肥處理后土壤基本性質

2.2 番茄植株生長指標及產量、品質

從圖1可以看出，隨著生長時間的延長，番茄的株高和葉綠素含量逐漸增加，莖粗先升高后降低，在5月26日、6月25日測量值相對較高，各處理的株高、莖粗、葉綠素含量無顯著差異，僅在5月26日，CMR80處理組番茄葉片的葉綠素含量顯著低于CMR70、CMR90處理組，與CMR60處理組無顯著差異，在7月25日，CMR70、CMR90處理組番茄株高顯著高于CMR60、CMR80處理組，且兩者之間無顯著差異。

圖1 中藥渣有機肥配施化肥對番茄株高、莖粗、葉片葉綠素含量的影響

由表3可知，各處理組的產量無顯著差異，其中CMR70處理組產量最高。CMR60、CMR80處理組番茄的可溶性固形物含量最高，顯著高于其他處理組，但兩者之間無顯著差異，其中CMR90處理組番茄可溶性固形物最低。CMR70、CMR90處理組番茄可滴定酸含量最低，顯著低于CMR60處理組，但兩者之間，以及它們與CMR80處理組均無顯著差異。

表3 中藥渣有機肥配施化肥對番茄產量及果實品質的影響

2.3 土壤測序結果與OTU特性分析

基于16 S rRNA的高通量測序，共獲得1892279個有效序列，其中，CMR60、CMR70、CMR80、CMR90處理組樣品的平均有效序列數分別為125523±5769、116546±5312、122016±8927、108985±9645。對每組樣品隨機抽取91276條序列進行抽平，在0.95相似水平下進行聚類，得到每組樣本OTU數（圖2）。CMR60處理組樣品中細菌群落OTU數是13531，CMR60處理組樣品中細菌群落OTU數是13190，CMR60處理組樣品中細菌群落OTU數是13382，CMR60處理組樣品中細菌群落OTU數是11568。各處理共同的OTU數為3932（圖2），特有的OTU數相對較少，CMR60、CMR70、CMR80、CMR90分別為4966、4871、3938、4865。

圖2 土壤樣品中微生物群落OTU維恩圖

2.4 土壤微生物多樣性分析

土壤樣品的Alpha多樣性結果見表4。4個土壤樣本覆蓋率均達到99.3%以上，說明測序深度較高，基本能覆蓋樣品中所有物種，能夠真實地反映土壤微生物的群落組成。

細菌群落結構豐富度和多樣性主要是由代表OTUs統計的物種數Observed spieces、表征菌群豐度的Chao 1指數（Chao 1 index），以及反映菌群多樣性的香濃指數（Shannon index）和辛普森指數（Simpson index）來表示。從表4可以看出，隨著化肥用量的增加，土壤物種數、Chao 1指數、進化多樣性指數（Faith’s PD）均逐漸降低，其中CMR90處理組Chao 1指數、土壤物種數顯著低于其他各處理組，進化多樣性指數僅顯著低于CMR60處理組，其他各處理組之間的土壤物種數、Chao 1指數、進化多樣性指數均無顯著差異。香濃指數隨著化肥使用量的增高出現先升高后降低的趨勢，并在CMR70處理組達到最高值，但各處理之間不具有顯著差異。這說明化肥的施用量能夠影響土壤細菌群落的豐富度和多樣性。

表4 不同處理土壤細菌菌群的豐度和多樣性比較

2.5 土壤微生物群落結構分析

在門水平上，4組土壤樣品中優勢細菌從高到低依次為變形菌門Proteobactreia、放線菌門Actinobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、綠彎菌門Chloroflexi、擬桿菌門Bacteroidetes（圖3）。其中，變形菌門和放線菌門在各處理樣品中占比最大，為本研究區土壤優勢細菌的菌門。在不同處理下的土壤樣品中，變形菌門相對豐度大小依次是CMR60（38.45%）＞CMR70（37.48%）＞CMR90（36.87%）＞CMR80（36.39%）；放線菌門相對豐度大小依次是CMR80（18.86%）＞CMR60（18.48%）＞CMR70（17.51%）＞CMR90（16.68%）；酸桿菌門相對豐度大小依次是CMR70（11.30%）＞CMR80（9.96%）＞CMR90（9.57%）＞CMR60（8.47%）；芽單胞菌門相對豐度大小依次是CMR90（10.47%）＞CMR70（8.29%）＞CMR60（8.26%）＞CMR80（8.05%）；綠彎菌門相對豐度大小依次是CMR80（8.94%）＞CMR60（8.65%）＞CMR90（8.55%）＞CMR70（8.14%）；擬桿菌門相對豐度大小依次是CMR80（8.39%）＞CMR90（8.00%）＞CMR60（7.83%）＞CMR70（7.32%）。總體來看，CMR60處理組土壤樣品中變形菌門相對豐度較其他處理組高，CMR70處理組土壤樣品中酸桿菌門相對豐度較其他處理組高，CMR80處理組土壤樣品中放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門相對豐度較其他處理組高，CMR90處理組土壤樣品中芽單胞菌門相對豐度較其他處理組高。

圖3 門水平上土壤細菌菌群的組成結構

在屬水平上，不同處理的優勢菌屬基本相似，分別為MND1、Subgoup10、Iamia、特呂珀菌屬Truepera、Pelagibius、鏈霉菌屬Streptomyces、蒼白桿菌屬Ochrobactrum、芽單胞菌屬Gemmatimonas、交替赤桿菌屬Altererythrobacter、假單胞菌屬PseudCMRonas、鞘脂單胞菌屬SphingCMRonas、RB41、馬杜拉放線菌屬Actinomadura、溶桿菌屬Lysobacter、硝化螺菌屬Nitrospira、Haliangium、類諾卡氏屬Nocardioides、藤黃色單胞菌屬Luteimonas、芽孢桿菌屬Bacillus、Ilumatobacter（圖4）。其中，CMR60處理組土壤樣品中的優勢屬（相對豐度＞1%）依次是MND1 2.82%、Iamia1.28%、馬杜拉放線菌屬1.18%、鏈霉菌屬1.15%、Pelagibius1.14%、特呂珀菌屬1.09%；CMR70處理組土壤樣品中的優勢屬（相對豐度＞1%）依次是MND1 2.87%、Subgroup10 1.51%、Iamia1.26%、假單胞菌屬1.20%、RB41 1.06%、鞘脂單胞菌屬1.04%；CMR80處理組土壤樣品中的優勢屬（相對豐度＞1%）依次是MND1 2.34%、假單胞菌屬1.30%、Iamia1.21%、Subgroup10 1.20%、鏈霉菌屬1.00%；CMR90處理組土壤樣品中的優勢屬（相對豐度＞1%）依次是MND1 2.08%、特呂珀菌屬1.41%、Iamia1.31%、Pelagibius1.25%、Subgroup10 1.24%、蒼白桿菌1.19%。另外，MND1、RB41、鞘脂單胞菌屬、溶桿菌屬、Nitrospira的相對豐度在4個處理組中出現了先升高后逐步減低的趨勢，在CMR70處理組中達到最高值。

圖4 屬水平上土壤細菌菌群的組成結構

2.6 土壤菌群結構與環境因子的冗余分析

采用冗余分析（RDA）方法探討了土壤理化性質與細菌群落結構的關系（圖 5）。圖中不同顏色的點表示不同處理的樣品，各處理樣品分布點并沒有顯著地分隔開，說明不同施肥處理對土壤細菌群體結構沒有產生顯著的影響。圖5中紅色箭頭分別代表不同的環境因子，藍色箭頭代表不同的微生物。環境因子之間的夾角為銳角時，表示2個環境因子之間呈正相關，鈍角時則呈負相關。物種與環境因子之間的夾角代表物種與環境因子間的正、負相關關系（銳角：正相關；鈍角：負相關；直角：無相關性），環境因子的射線越長，說明該影響因子的影響程度越大。

從圖5可以看出，pH值與總磷之間呈正相關，兩者與總鉀呈正相關，與有機質、總氮呈負相關；有機質與總氮之間呈正相關?？傗泴Ω魈幚砑毦郝浣Y構的影響程度最大，其次是總磷和pH值?？傗浥c蒼白桿菌屬、Pelagibius、特呂珀菌屬呈正相關，與Subgoup10、Iamia、MND1、鏈霉菌屬、馬杜拉放線菌屬、溶桿菌屬呈負相關；總磷、pH值與芽單胞菌屬、硝化螺菌屬、RB41呈正相關，與溶桿菌屬、馬杜拉放線菌屬、鏈霉菌屬、Iamia呈負相關；總氮、有機質與溶桿菌屬、交替赤桿菌屬、馬杜拉放線菌屬、假單胞菌屬呈正相關，與硝化螺菌屬、RB41、鞘脂單胞菌屬、芽單胞菌屬呈負相關。

圖5 基于屬水平細菌群落的組成與土壤理化性質的RDA分析

3 結果與分析

本研究結果顯示，不同施肥處理后土壤有機質含量由高到低依次為CMR80＞CMR90＞CMR60＞CMR70。CMR80處理組的土壤全氮含量增加，全磷、全鉀含量降低，其他各處理組的土壤氮、磷、鉀養分含量與處理前無明顯變化。從處理后的土壤養分含量可以看出，中藥渣有機肥的施用能夠顯著增加土壤有機質含量，而不同化肥施用量處理對土壤有機質、氮、磷、鉀養分的利用效果也各不相同。從番茄長勢來看，CMR70處理組的番茄植株長勢相對較好；從產量、品質數據來看，CMR70處理組番茄產量相對較高，且可滴定酸含量相對較低，口感較好。

從土壤樣品的Alpha 多樣性分析結果可以看出，在中藥渣有機肥施用量一定的前提下，隨著化肥用量的增加，土壤物種數、土壤Chao 1指數、進化多樣性指數均逐漸降低。其中，CMR90處理組化肥施用量最高，其土壤微生物Chao 1指數、物種數最低，且顯著低于其他各處理組；進化多樣性指數最低，且顯著低于CMR60處理組，與其他處理組無顯著差異。CMR70、CMR80、CMR90處理組的物種數、Chao 1指數、進化多樣性指數均無顯著差異。香濃指數隨著化肥使用量的增高出現先升高后降低的趨勢，并在CMR70處理組達到最高值。這充分說明化肥的施用量能夠影響土壤細菌群落的豐富度和多樣性，在中藥渣有機肥施用量一定的前提下，施用化肥的量越多，土壤微生物的多樣性反而越低。

從土壤微生物群落結構分析可以看出，不同處理組土壤中的優勢菌門基本相似，分別為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、擬桿菌門，這與之前的研究結果相似［25-26］，但各處理中優勢菌門的相對豐度具有一定差異，CMR60處理組中變形菌門相對豐度較高，CMR70處理組中酸桿菌門相對豐度較高，CMR80處理組中放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門相對豐度較高，CMR90處理組中芽單胞菌門相對豐度較高。這也說明了在中藥渣有機肥施用量一定的前提下，土壤微生物群落結構受化肥施用量的影響。

在本研究中，土壤變形菌門占絕對優勢，與之前很多土壤細菌群落研究的結果相似，都具有很高的相對豐度［27-28］。變形菌門屬于異養型細菌，包含有能與植物共生的固氮細菌，可以增強土壤的固氮能力。有研究表明，土壤變形菌門豐富度的高低在一定程度上反映了土壤有機質等養分含量的高低［29-30］。放線菌是一類具有重要生物活性的功能性微生物，能產生種類繁雜和富含生物活性的次級代謝產物，還能產生各類酶、有機酸等，有助于分解有機物和礦物質［31］，同時它具有良好的抗菌活性和耐鹽堿作用［32-33］。酸桿菌門細菌也是土壤微生物的重要成員，在土壤物質循環和生態環境構建過程中起到非常重要的作用［34-35］。Fierer 等［36］研究發現，施氮量對細菌多樣性沒有產生顯著的影響，但施氮對細菌群落結構的影響顯著，其中富營養細菌，如變形菌門和擬桿菌門相對豐度隨施氮量的增加而上升，而寡營養細菌主要是酸桿菌卻表現出相反的趨勢。Ramirez 等［37］對采自不同生態環境下的 28 個土壤氮素添加試驗發現，施氮增加了放線菌和Firmicute細菌的相對豐度，但降低了酸桿菌和Verrucomicrobia細菌的相對豐度。本研究結果顯示，隨著氮磷鉀肥料施用量的增加，酸桿菌門的相對豐度出現了先升高后降低的趨勢，與之前的研究不盡相同。綠彎菌門是一類通過光合作用產生能量的細菌，廣泛分布在生物圈的各種環境中，參與了 C、N、S 等元素的生物地球化學循環，是所在環境生態學過程的重要參與者［38］。擬桿菌具有溶磷作用，一些菌屬能夠分泌有機酸和磷酸酶將難溶性磷轉化為可以被植物吸收利用的H2PO4-和 HPO42-這2種磷的形態［39］，提高了植物對磷的吸收和利用，促進了植物生長［40］。

通過冗余分析可知，有機質和全氮、全磷、全鉀對土壤微生物群落結構都有影響，其中全鉀的影響程度最大，可能是由于有機質及氮、磷、鉀養分為土壤微生物提供了重要的能量來源，促進了土著優勢種群的生長繁殖，而不利于一些非優勢種群及對環境變化敏感種群微生物的生長與豐度的增加，但隨著養分的過量積累反而不利于土壤細菌群落結構組成的變化［41-43］。