外源甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗生理特性的影響

華智銳，崔 行，李小玲

（1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，陜西 商洛 726000）

龍膽（Gentiana scabraBge），是龍膽科植物，分為條葉龍膽（Gentiana manshuricaKitag）、龍膽（Gentiana scabraBge）和三花龍膽（Gentiana trifloraPall）［1］。屬多年生草本植物，高可達60 cm，種子顆粒極小，千粒質(zhì)量約0.1 g。其根和根莖入藥，味苦、性寒，它們具有藥用價值，大多具有清熱解毒、止咳清濕熱、鎮(zhèn)舒筋止痛等功效，對于治療疾病有重大作用［2］；同時其也具有觀賞價值，它屬于野生藍色花卉，而藍色是園林花卉應(yīng)用中觀賞價值很高的色系。龍膽草適宜生長在有光、涼爽的環(huán)境中，我國大多數(shù)的土壤條件都可以生長龍膽［1,3］。

非生物脅迫是在特定的環(huán)境下，在整個植物生命周期中，任何非生物因素如干旱、鹽堿脅迫等都對植物造成的不利影響。鹽脅迫是其中之一，主要表現(xiàn)在滲透脅迫、離子毒害、營養(yǎng)失衡和氧化應(yīng)激這4個方面［3］，從而阻礙植物正常的生長發(fā)育。現(xiàn)如今，鹽堿地是陸地上分布較廣泛的一種土地資源，總面積達到2000萬hm2，約占總耕地面積的10%，已成為全球重要的后備土地資源［4］。目前，土壤鹽漬化已經(jīng)成為制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的因素之一，它導(dǎo)致土壤性質(zhì)發(fā)生改變，使植物缺乏生長發(fā)育所需的營養(yǎng)元素，破壞植物的生長進程，從而導(dǎo)致作物減產(chǎn)［5］。因此，開發(fā)利用鹽堿地是我們亟待解決的問題。當(dāng)植物受到鹽脅迫時，其生長受到抑制，代謝失調(diào)，葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的變化，光合作用受阻，光合速率下降，導(dǎo)致生物量降低，嚴(yán)重時會出現(xiàn)植株萎蔫，甚至死亡［6］。

甘氨酸甜菜堿(Glycine betaine，GB)是一種非毒性的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，也是一種生理抗旱劑，它廣泛分布于植物、動物和細(xì)菌體內(nèi)［7］。當(dāng)植物遇到逆境時，其細(xì)胞膜透性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、酶系統(tǒng)、光合指標(biāo)等都會受到影響。在鹽脅迫下，植物提高適應(yīng)性的原理是通過提高體內(nèi)甜菜堿的醛脫氫酶活性，進而提高甜菜堿含量，減少植物受傷害的程度。近年來，甜菜堿與植物抗逆性結(jié)合的研究受到廣泛關(guān)注。研究者表明分別用5 mmol/L和10 mmol/L濃度的甜菜堿溶液澆灌小麥根部，小麥幼苗的相對含水量和抗旱性均會顯著提高。甜菜堿可以作為酶的保護劑，在鹽脅迫下保護細(xì)胞膜的完整性。李善家等［8］研究表明，在鹽脅迫的逆境條件下，施加25 mmol/L濃度的甜菜堿，黑果枸杞種子的萌發(fā)率以及抗氧化物酶活性顯著提高。代歡歡等［9］研究表明外源甜菜堿提高了顛茄葉片的凈光合速率，幼苗保護酶體系的活性均有不同程度的提高。凌欣聞［10］研究了外源甜菜堿對草地早熟禾耐鹽性的影響。

綜上所述，外源甜菜堿對鹽脅迫下植物的生理特性影響較大。但是，外源甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗生理指標(biāo)的影響暫無相關(guān)研究。因此，深入研究鹽分脅迫條件下噴施甜菜堿（GB）對龍膽生理生化特性的影響過程，探索噴施外源物質(zhì)對龍膽適應(yīng)鹽分脅迫的調(diào)控機理，對于補充完善施用外源物質(zhì)（如GB）對龍膽耐鹽能力的調(diào)控理論具有重要的理論與實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

購買的龍膽幼苗來自浙江杭州試驗基地。將龍膽幼苗移栽至直徑15 cm×20 cm的塑料花盆中，當(dāng)幼苗長12 cm時，用營養(yǎng)土和普通土按照1∶1比例制成基質(zhì)進行培養(yǎng)。為了使幼苗盡快恢復(fù)正常的生理狀況，每天定時澆水、松土，使其生長在良好的環(huán)境中。每個處理的澆水量一致。每盆3株，每個處理6盆，1周后隨機選取處理的幼苗用于生理指標(biāo)的測定。

1.2 試驗設(shè)計

選擇長勢良好的植株，用濃度為13.15 mmol/L的NaCl溶液處理，每盆澆灌200 mL NaCl溶液，1周澆灌1次。在此期間，對龍膽幼苗噴灑不同濃度的甜菜堿，GB設(shè)置4個處理濃度，分別為50、100、150、200 mmol/L。在葉片正反兩面均勻噴施，每天處理2次，每個處理3次重復(fù)，連續(xù)處理7 d。根據(jù)試驗要求將幼苗分成6組，如表1所示。

表1 不同處理下NaCl和甜菜堿的處理水平

1.3 幼苗指標(biāo)測定

處理7 d后，對龍膽幼苗的生理指標(biāo)及凈光合速率進行測定。測定方法如下：SOD活性的測定參照李合生［12］的氮藍四唑法；POD活性的測定參照李合生［12］的愈創(chuàng)木酚法；CAT活性的測定參照高俊鳳［13］的紫外吸收法；葉綠素含量的測定參照張志良等［14］的丙酮-碳酸鈣法；MDA含量的測定參照張志良等［14］的硫代巴比妥酸（TBA）檢測法；可溶性蛋白含量的測定采用高俊鳳［13］的考馬斯亮藍G-250法；脯氨酸含量的測定參照酸性茚三酮法。

光合指標(biāo)使用美國LI-COR公司的LI-6400便攜式光合作用測定儀測定。于上午9:00～11:00分別測定對照組和處理組葉片的凈光合速率(Pn)參數(shù)，測定時外界大氣CO2濃度為500 μL/L，光照強度設(shè)為1000 μmol/（m2·s）。每組測定3片不同植株葉片，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)方差分析，用Excel 2010軟件作圖。各項指標(biāo)測定3次，求其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗脯氨酸含量的影響

由圖1可知，只進行鹽脅迫（CK1）時，脯氨酸的含量較CK顯著升高（P＜0.05），漲幅為17.8%，說明NaCl脅迫對龍膽幼苗中脯氨酸的含量有顯著影響。添加不同濃度的甜菜堿時，脯氨酸的含量相對于CK1來說大幅上升，增幅分別為29.5%、32.8%、99.9%、22.7%，呈現(xiàn)了先上升后下降的變化趨勢。T3的脯氨酸含量與T1、T2、T4的差異顯著。結(jié)果表明，不同濃度的甜菜堿梯度（T1、T2、T3、T4）均可以提高龍膽幼苗中脯氨酸含量，促進幼苗的生長發(fā)育。其中當(dāng)GB濃度為150 mmol/L時，脯氨酸含量達到最大漲幅,作用效果最佳。

圖1 甜菜堿對鹽脅迫下龍膽葉片脯氨酸含量的影響

2.2 外源甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，在13.15 mmol/L NaCl脅迫（CK1）下，POD的活性水平較CK增長了10.1%。在相同濃度NaCl脅迫下，施加不同濃度的GB（T2～T4）均使POD活性相比于CK1顯著增加，增幅分別為57.0%、42.8%、29.0%。T1的POD活 性 與T3、T4差異不明顯，而T2與T1、T4差異較為明顯，且在GB濃度為T2（即100 mmol/L）時達到最大增幅。結(jié)果表明，GB對提高NaCl脅迫下POD活性作用顯著，但并不是濃度越高效果越佳，作用效果最顯著的濃度為100 mmol/L。

圖2 甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗POD活性的影響

由圖3可知，在13.15 mmol/L NaCl脅迫（CK1）下，SOD的活性較CK顯著提高（P＜0.05），漲幅為46.6%，說明NaCl脅迫處理對龍膽幼苗中的SOD活性有顯著影響。在相同濃度NaCl脅迫下，施加不同濃度GB（T1～T4）均使SOD活性顯著增加，增幅分別為12.7%、42.7%、56.3%、55.9%，呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。T3的SOD活性與T4差異不明顯，而T3的SOD活性與T1、T2差異顯著，即在GB濃度為150 mmol/L時，SOD活性達到最大漲幅。結(jié)果表明，當(dāng)GB濃度為150 mmol/L時，對NaCl脅迫下龍膽幼苗的SOD活性的影響最顯著。

圖3 甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗SOD活性的影響

由圖4可知，在13.15 mmol/L NaCl脅迫（CK1）下，CAT活性較CK無明顯提高（P＞0.05），漲幅為0.58%，說明NaCl脅迫處理對龍膽幼苗中的CAT活性影響不大。在相同濃度NaCl脅迫下，施加不同濃度GB（T1～T4）均使CAT活性相比于CK1顯著增加，增幅分別為40.6%、41.7%、167.0%、17.9%，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。T3的CAT活性與T1、T2、T4差異明顯,即GB濃度為150 mmol/L時達到最大增幅。結(jié)果表明，GB對NaCl脅迫下CAT活性的影響顯著，但并不是濃度越高影響越大，影響最顯著的濃度為150 mmol/L。

圖4 甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗CAT活性的影響

2.3 外源甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗膜脂過氧化的影響

由圖5可知，在13.15 mmol/L NaCl脅迫（CK1）下，葉片中過氧化物MDA的含量較CK顯著提高（P＜0.05），漲幅為60%，說明NaCl脅迫處理對龍膽幼苗的脅迫傷害較為嚴(yán)重。在相同濃度NaCl脅迫下，施加不同濃度GB（T1～T4）均使MDA含量較CK1顯著減小，減幅分別為4.7%、20.6%、28.6%、26.8%。T3的MDA含量降幅與T1、T2、T4的差異顯著。結(jié)果表明，NaCl脅迫（CK1）對龍膽幼苗MDA的含量影響顯著，但添加不同濃度GB可以緩解NaCl脅迫下龍膽幼苗膜脂過氧化傷害程度，其中GB最佳處理濃度為150 mmol/L。

圖5 甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗MDA含量的影響

2.4 外源甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗葉綠素含量的影響

由圖6～圖8可知，NaCl脅迫（CK1）的龍膽幼苗體內(nèi)的總?cè)~綠素、葉綠素b含量與CK相比均顯著降低（P＜0.05），說明NaCl脅迫處理對龍膽葉片的光合色素含量有顯著影響。在鹽脅迫下會改變光合色素的含量，進而造成光合性能的改變，最終影響植物的生長發(fā)育。由圖6可知，噴灑不同濃度的甜菜堿顯著提升了葉綠素的含量，相對于NaCl脅迫處理來說大幅上升，增幅分別為46.0%、47.5%、64.0%、43.0%，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中在GB濃度為T3時達到最大漲幅，葉綠素含量變化最顯著。從圖7與圖8中也可以看出，GB濃度為T3時葉綠素a和葉綠素b積累效果最佳。綜合表明，添加外源甜菜堿可以顯著提升幼苗的光合能力，且GB濃度為150 mmol/L處理效果最佳。

圖6 甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗葉綠素含量的影響

圖7 甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗葉綠素a含量的影響

圖8 甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗葉綠素b含量的影響

2.5 外源甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗光合速率（Pn）的影響

由圖9 可知，在13.15 mmol/L NaCl 脅迫（CK）下，光合速率較CK 顯著下降（P＜0.05），減幅為25.0%，說明NaCl 脅迫處理對龍膽幼苗的光合速率有顯著影響。在相同濃度NaCl 脅迫下，施加不同濃度GB（T1～T4）均使光合速率Pn 較CK1有不同程度的提高，漲幅分別為20.7%、14.4%、65.6%、13.2%，大致呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中T3 組表現(xiàn)最好，即在GB 濃度為150 mmol/L 時達到最大增幅，T3 的光合速率與T1、T2、T4 的差異顯著，結(jié)果表明，GB 對提高NaCl 脅迫下的光合速率Pn 效果顯著。

圖9 甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗光合速率Pn的影響

2.6 外源甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗可溶性蛋白含量的影響

由圖10可知，在13.15 mmol/L NaCl脅迫（CK1）下，其可溶性蛋白含量較CK顯著下降（P＜0.05），降幅為77.5%，說明NaCl脅迫處理對龍膽幼苗的可溶性蛋白含量有顯著影響。在相同濃度NaCl脅迫下，施加不同濃度GB（T1～T4）均使可溶性蛋白含量較CK1有不同程度的提高，漲幅分別為12.1%、39.0%、53.0%、23.7%，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中T3組表現(xiàn)最好，達到最大增幅,T3的可溶性蛋白含量與T1、T2、T4的差異顯著，結(jié)果表明GB對提高NaCl脅迫下可溶性蛋白含量的效果顯著，其中處理效果最顯著的濃度為150 mmol/L。

圖10 甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗可溶性蛋白含量的影響

3 討論

3.1 外源甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗抗氧化酶活性的影響

植物在處于逆境脅迫時，體內(nèi)的活性氧簇（ROS）顯著增強，為了抵抗鹽脅迫的迫害，植物體內(nèi)的抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性增強，以便清除產(chǎn)生的活性氧，維持體內(nèi)活性氧的平衡，抵御鹽脅迫對植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞。本實驗研究表明，在13.15 mmol/L NaCl脅迫下，龍膽幼苗體內(nèi)的SOD、POD、CAT活性均有顯著提高，說明在逆境脅迫下，植物體可通過自身調(diào)節(jié)保護酶的活性，防御自由基對細(xì)胞的侵害。李善家等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在100 mmol/L NaCl脅迫下，黑果枸杞幼苗體內(nèi)的保護酶活性與對照組相比，呈現(xiàn)了不同程度的上升趨勢；代歡歡等［9］研究表明，鹽脅迫顯著提高了顛茄幼苗體內(nèi)SOD、POD、CAT的活性；上述結(jié)果與本實驗研究結(jié)果一致。添加不同濃度的外源甜菜堿可以有效緩解鹽脅迫的傷害。在本實驗中，施加GB濃度為100 mmol/L時，POD活性最顯著；GB濃度為150 mmol/L時，SOD、CAT活性最顯著，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，表明甜菜堿可以提高植物自身抵御非生物脅迫的能力。代歡歡等［9］研究表明20 mmol/L甜菜堿處理能夠提高3種抗氧化酶的活性。趙金莉等［17］研究表明，向黃瓜葉面噴施甜菜堿能夠提升鹽脅迫下抗氧化酶的活性。本實驗研究結(jié)論與前人一致，說明外源GB可以調(diào)節(jié)保護酶系統(tǒng)，提高幼苗抵御NaCl脅迫的迫害。在NaCl濃度為13.15 mmol/L、GB濃度為150 mmol/L時效果最佳；但POD活性的最大增幅的濃度與CAT、SOD不同。在正常情況下，3種抗氧化酶活性在鹽脅迫的環(huán)境下，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，即在本實驗中正好在GB濃度為150 mmol/L時出現(xiàn)峰值，SOD、CAT活性也在此濃度下漲幅最大；而POD活性在GB濃度為150 mmol/L時未呈現(xiàn)最大漲幅，原因可能是在測量POD活性時取材時間較晚。

3.2 外源甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗膜脂過氧化的影響

當(dāng)植物處于逆境脅迫時，體內(nèi)含有大量的活性氧自由基，造成細(xì)胞膜過氧化，而丙二醛是膜脂化的產(chǎn)物，其含量可衡量植物受傷害程度的大小。陸安橋等［5］發(fā)現(xiàn)湖南稷子幼苗葉片，在經(jīng)過鹽脅迫處理后MDA含量顯著增加；張?zhí)禊i等［18］研究表明，根灌濃度為13.15 mmol/L甜菜堿，顯著降低了NaCl脅迫下小麥的MDA的含量，并且隨著濃度的增加有先下降后上升的趨勢。李善家等［8］研究發(fā)現(xiàn)，20 mmol/L甜菜堿處理顛茄幼苗，能顯著降低MDA含量，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。本研究表明13.15 mmol/L NaCl脅迫下龍膽幼苗的MDA含量較對照組顯著增加，添加不同濃度的GB均可顯著降低NaCl脅迫下MDA含量，并在GB濃度為150 mmol/L時達到最低值，這與前人的研究結(jié)論一致。說明外源甜菜堿可以緩解膜脂過氧化程度，提高龍膽幼苗的耐鹽性。

3.3 外源甜菜堿對鹽脅迫下龍膽幼苗葉綠素含量、凈光合速率的影響

光合反應(yīng)是植物最重要的生理反應(yīng)之一，它對植物的生長發(fā)育有重要影響。光合色素是衡量植物光合能力強弱的重要因素之一［19］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在13.15 mmol/L NaCl脅迫下，龍膽幼苗的葉綠素b和總?cè)~綠素含量相比于對照組（CK）顯著下降，表明鹽脅迫傷害了植物的葉綠體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致光合色素減少。而添加不同濃度的甜菜堿溶液，可以緩解鹽脅迫的迫害。代歡歡等［9］研究表明，20 mmol/L的GB溶液可以有效提高顛茄幼苗的光合色素,促進光合作用的進行；米永偉等［4］研究表明，外源甜菜堿有助于增強鹽脅迫下黑果枸杞幼苗的光合作用。本試驗研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致。說明在GB濃度為150 mmol/L時，鹽脅迫下的龍膽幼苗可以維持較高的光合色素含量。

3.4 外源甜菜堿對鹽脅迫下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

植物在受到干旱、鹽脅迫時，自身會產(chǎn)生一種基礎(chǔ)的調(diào)節(jié)方式：滲透調(diào)節(jié)［20］。在生理水平上，滲透調(diào)節(jié)是參與干旱和鹽度耐受的適應(yīng)性機制［21］。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要包括無機和有機兩種形式，脯氨酸、可溶性蛋白是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可溶性蛋白是植物抗旱性的重要指標(biāo)之一。本實驗研究表明，在13.15 mmol/L NaCl脅迫下龍膽幼苗中游離脯氨酸的含量顯著升高，極大程度地抵御傷害，這與代歡歡等［9］的研究結(jié)果一致。添加不同濃度的外源甜菜堿可以促進脯氨酸、可溶性蛋白的積累，促進植物的生長發(fā)育，這與趙金莉等［17］在黃瓜上的研究結(jié)果一致。說明在GB濃度為150 mmol/L時，脯氨酸的含量積累最多，緩解鹽脅迫的效果最好。

4 小結(jié)

在試驗處理下，龍膽幼苗中POD、SOD、CAT活性的變化趨勢相同，在13.15 mmol/L NaCl 脅迫下，相比于對照組顯著增加。在相同鹽脅迫下，添加不同濃度的外源甜菜堿溶液后，抗氧化酶活性顯著提升，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。POD 活性在GB 濃度為100 mmol/L 時表現(xiàn)最好，SOD、CAT活性在GB 濃度為150 mmol/L 時表現(xiàn)最顯著。MDA 是膜脂化產(chǎn)物，脯氨酸是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在鹽脅迫下兩者含量顯著增加；添加甜菜堿后，MDA、脯氨酸含量逐漸減少，在GB 150 mmol/L下表現(xiàn)顯著，減幅最大，表明外源甜菜堿可以有效緩解鹽脅迫對細(xì)胞膜的傷害。光合色素受逆境的影響，在13.15 mmol/L NaCl 脅迫下，葉綠素b含量、凈光合速率逐漸降低，施加甜菜堿后，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)受到脅迫時，可溶性蛋白質(zhì)含量先升后降，在添加甜菜堿后，可溶性蛋白大量積累，保護植物免受破壞。

綜上所述，外源甜菜堿作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過添加不同濃度的處理，可以有效緩解鹽脅迫對龍膽幼苗的傷害，其中甜菜堿濃度為150 mmol/L 處理時效果最佳。