環(huán)割對馬家柚蔗糖和檸檬酸含量及其相關(guān)基因表達的影響

趙連鑫，王 鑫，何 彩，牟德生，郭艷蘭，史星雲(yún)，韓登山，姚元文

（1.武威市林業(yè)科學(xué)研究院，甘肅 武威 733000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070；3.湖州市農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中心/湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 湖州 313000）

環(huán)割是果樹栽培管理中常用的一種技術(shù)措施，具有保花保果和提高果實品質(zhì)的作用。環(huán)割時間和圈數(shù)是影響環(huán)割效應(yīng)的主要因素，筆者前期對不同環(huán)割時間、環(huán)割圈數(shù)對馬家柚（Citrus grandisL.Osbeck）環(huán)割試驗表明，不同環(huán)割處理對馬家柚果實糖酸的影響顯著［1］。柑橘果實中主要含有蔗糖和果糖等［2］，其中，柚類果實中蔗糖含量最高，糖含量的變化與糖代謝途徑中相關(guān)的酶有著緊密的聯(lián)系，因而決定果實中糖含量的酶有很多。

20世紀90年代，在玉米和菠菜中對植物細胞質(zhì)進行純化得到了蔗糖磷酸化酶SPS［3］，它可催化果糖轉(zhuǎn)化為蔗糖，在香瓜中也證實了這一點［4］。蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（SUC）是質(zhì)膜上轉(zhuǎn)運蔗糖的載體，與蔗糖的裝卸有密切關(guān)系［5-6］。SUC是一個多成員的基因家族［7］，根據(jù)不同的性質(zhì)將其分成3個亞族：SUC1、SUC2、SUC3和SUC4，它們在植物的不同組織和器官中存在著不同的表達。有機酸的代謝是一個復(fù)雜的過程，有很多相關(guān)的酶參與其中，不同的酶在果實的有機酸代謝中起著不同的作用。柑橘果實存在著豐富的有機酸，主要有檸檬酸、蘋果酸和乙酸等［8-9］，其中檸檬酸是柑橘果實中含量最多的有機酸。文濤等［10］在臍橙果實酸代謝研究中發(fā)現(xiàn)，CS的表達與檸檬酸的代謝存在著正相關(guān)，但也有研究發(fā)現(xiàn)［11］，CS的表達與果實檸檬酸的含量無關(guān)，說明在不同品種中相同的基因有著特異性的表達，這也決定了在不同的果樹品種中研究每個基因的必要性。ACO又稱烏頭酸水合酶，研究發(fā)現(xiàn)在果實中它具有2種形態(tài)：線粒體ACO和胞質(zhì)ACO［12］，其表達量與檸檬酸密切相關(guān)［13］，在甜來檬研究中發(fā)現(xiàn)，它與檸檬酸的含量呈負相關(guān)［14］。

為了解環(huán)割對柚子果實糖、酸含量變化的原因，本研究以馬家柚為試材，設(shè)置不同環(huán)割時間和圈數(shù)處理，選擇與糖酸相關(guān)的SUC1、SUC2、SUC3、SUC4、CS、ACO等6個基因，研究了環(huán)割對馬家柚果實中糖、酸（蔗糖、檸檬酸）含量的變化及相關(guān)基因的表達情況，以期明確環(huán)割后相關(guān)基因的表達與糖酸含量變化的關(guān)系，從而分析了環(huán)割措施對提高果實品質(zhì)的原因。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗地概況：試驗地設(shè)在江西省廣豐區(qū)瀛洲農(nóng)業(yè)公司基地，位于江西省上饒市廣豐區(qū)，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均無霜期266 d，年平均氣溫17.9℃，年平均降雨量1661.6 mm，土壤以紅壤、黃壤為主。基地果園內(nèi)只栽植馬家柚，澆水、施肥和病蟲害防治等統(tǒng)一管理。

試驗材料選擇樹勢、掛果量一致的10年生柚樹，在第1次生理落果期（5月15日）和第2次生理落果期（6月15日）進行環(huán)割處理，設(shè)環(huán)割1、2、3圈處理，每株只環(huán)割3個粗度一致的主枝，在主枝基部處進行環(huán)割，環(huán)割刀口寬度1 mm，圈距2 cm，每個處理3株。果實成熟后（11月15日），采集環(huán)割枝上同一方位、同一大小、同一成熟度的果實，取果實中部果肉液氮處理后，用于糖酸含量和糖酸相關(guān)基因表達量的測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 糖酸含量的測定 果實中糖和酸采用氣相色譜儀（Agilent 6890N）測定，具體方法參考文獻［15］；色譜條件：HP-5色譜柱，分流/不分流進樣口溫度270 ℃，檢測器溫度300 ℃；氣體流速：高純N2作載體，流量為45 mL/min；H2的流量為40 mL/min，空氣流量為450 mL/min，柱頭壓12.00 psi，進樣量1 μL，分流比30∶1，分流流速60.1 mL/min；在升溫程序中，初溫130 ℃，以8 ℃/min升至152 ℃，12℃/min升至176 ℃，16 ℃/min升至198 ℃，20 ℃/min升至238 ℃，24 ℃/min升至280 ℃，280 ℃保留4 min，最大溫度不超過325 ℃。

1.2.2 糖酸相關(guān)基因篩選及引物設(shè)計 從NCBI數(shù)據(jù)庫中，篩選出與柑橘糖、酸代謝相關(guān)基因序列7條，其中蔗糖磷酸化酶1條（SPS）、蔗糖轉(zhuǎn)運因子3條（SUC1/SUC3/SUC4）、烏頭酸水合酶1條（ACO）、檸檬酸合成酶1條（CS4），用Primer Express 3.0軟件設(shè)計定量引物，以Actin為內(nèi)參基因，其中內(nèi)參基因及所選定量引物序列如表1所示。

表1 糖酸代謝相關(guān)基因引物用于Real-time PCR的引物

1.2.3 qRT-PCR測定 用中量法提取果實中的RNA，方法參考徐文欣［16］的研究，再經(jīng)qRT-PCR測定，測出糖酸相關(guān)基因的表達量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2007、SAS軟件（SAS System Release 8.1）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異顯著性分析，采用Primer Express 3.0軟件設(shè)計糖酸相關(guān)基因引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實蔗糖和檸檬酸的測定

由表2可知，不同環(huán)割處理果肉蔗糖含量均高于對照，蔗糖含量由高到低依次為：Ⅱ-1＞Ⅰ-3＞Ⅱ-3＞Ⅱ-2＞Ⅰ-1＞Ⅰ-2＞CK，Ⅱ-1、Ⅰ-3和Ⅱ-3處理的蔗糖含量較對照分別提高33.5%、13.7%、11.3%，差異顯著。果實中檸檬酸的含量由高到低依次為：Ⅱ-1＞Ⅰ-3＞Ⅰ-1＞CK＞Ⅱ-2＞Ⅰ-2＞Ⅱ-3。與CK相比，Ⅱ-1處理的檸檬酸含量最高，比對照高44.1%，差異顯著，Ⅱ-3處理的檸檬酸含量最低。

表2 環(huán)割處理后果實中可溶性糖、有機酸含量比較

2.2 對糖相關(guān)基因表達的影響

圖1顯示了馬家柚果實成熟期蔗糖相關(guān)基因的表達情況，A、B、C、D分別為CsSPS（蔗糖磷酸化酶）、CsSUC1、CsSUC3和CsSUC4（蔗糖轉(zhuǎn)運酶）。

圖1A顯示了各環(huán)割處理對馬家柚果實成熟期（180 DAF）CsSPS表達的影響。與CK相比，不同環(huán)割處理對CsSPS的表達量有升高也有降低的作用，Ⅱ-3處理對CsSPS的表達量最大，比對照高54%；Ⅰ-2和Ⅱ-1處理的表達量最低，比對照低63%和30%，其他處理與對照差異不顯著。各處理CsSPS的表達量與該處理下的蔗糖含量不一致。

圖1B顯示了各環(huán)割處理對馬家柚果實成熟期（180 DAF）CsSUC1表達的影響。與CK相比，Ⅱ-3處理顯著提高了CsSUC1的表達量，提高了144.1%，其他環(huán)割處理也提高了CsSUC1的表達量，與該處理下蔗糖的含量表現(xiàn)較為一致。

圖1C顯示了每種環(huán)割處理對馬家柚果實成熟期（180 DAF）CsSUC3表達的影響。與CK相比，不同環(huán)割處理對CsSUC3的表達有升高也有降低的作用，與各處理下蔗糖的含量不一致。

圖1D顯示了各環(huán)割處理對馬家柚果實成熟期（180 DAF）CsSUC4表達的影響。與CK相比，不同環(huán)割處理對CsSUC4的表達有升高也有降低的作用，各處理中CsSPS的表達量與該處理下蔗糖的含量不一致。

圖1 不同環(huán)割處理下果實中蔗糖相關(guān)基因表達量的比較

2.3 對酸相關(guān)基因表達的影響

圖2顯示了馬家柚果實成熟期（180DAF）檸檬酸代謝相關(guān)基因的表達情況，本課題組的前期研究表明：CsCS4（檸檬酸合成酶）和CsACO1（烏頭酸水合酶）2個基因在檸檬酸代謝途徑中具有重要作用。

圖2A顯示了環(huán)割處理對馬家柚果實成熟期（180 DAF）CsCS4表達的影響。與CK相比，各環(huán)割處理對CsCS4表達有影響，Ⅰ-2處理下的CsCS4表達量顯著高于其他處理和CK，與該處理下檸檬酸含量表現(xiàn)不一致。

圖2B顯示了環(huán)割處理對馬家柚果實成熟期（180 DAF）CsACO1表達的影響。與CK相比，不同的環(huán)割處理對CsACO1的表達有影響，Ⅱ-3處理顯著提高了CsACO1的表達量，高于對照26%，Ⅱ-1處理顯著降低了CsACO1的表達量，低于對照13%，與該處理下果實中檸檬酸含量較一致；其他處理對CsACO1的表達量，與該處理下果實中檸檬酸含量表現(xiàn)也較為一致。

圖2 不同環(huán)割處理下果實中檸檬酸相關(guān)基因表達量的比較

3 討論與結(jié)論

環(huán)割作為一種常用的栽培技術(shù)手段，已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)，其對果實品質(zhì)的影響主要表現(xiàn)在對糖、酸含量的變化上，相關(guān)的研究甚多［17-18］，具有升糖、降酸的效果，且可溶性糖上升的效果最顯著。本研究表明：不同的環(huán)割處理對馬家柚果實中蔗糖和檸檬酸含量均有影響，各環(huán)割處理均提高了果實中蔗糖的含量，Ⅱ-1、Ⅰ-3 和Ⅱ-3 處理的蔗糖含量分別較CK 高33.5%、13.7%、11.3%，且差異顯著。果實中檸檬酸含量中Ⅱ-1 處理的檸檬酸含量最高，比CK 高44.1%，且差異顯著；Ⅱ-3 處理的檸檬酸含量最低，這與涂美艷等［17］的研究結(jié)果一致，即環(huán)割對可溶性糖與總酸含量的表現(xiàn)一致。

另外，本研究還表明，環(huán)割對馬家柚蔗糖和檸檬酸相關(guān)基因表達的影響，與CK相比，環(huán)割處理后CsSPS、CsSUC1、CsSUC3和CsSUC4這4種基因的表達有升高也有降低的作用，其中，環(huán)割處理后CsSUC1的表達量與各處理下的蔗糖含量基本一致，其他3個蔗糖相關(guān)基因表達與蔗糖含量不一致。因此認為，環(huán)割處理可能對CsSUC1表達的影響較大，從而改變了果實中蔗糖的含量。環(huán)割對檸檬酸代謝相關(guān)基因的研究結(jié)果表明：環(huán)割對馬家柚果實中檸檬酸相關(guān)基因表達有影響，其中，環(huán)割處理后CsACO1的表達量與各處理檸檬酸含量基本一致，因此認為，環(huán)割處理中可能對CsACO1表達的影響較大，從而改變了果實中檸檬酸的含量。

綜上所述：環(huán)割處理果肉中蔗糖含量均高于對照，Ⅱ-1、Ⅰ-3和Ⅱ-3處理蔗糖含量較對照分別提高33.5%、13.7%、11.3%，差異顯著。第2次生理落果期環(huán)割1圈果實中檸檬酸含量最高，高于對照44.1%，差異顯著；第2次生理落果期環(huán)割3圈果實中檸檬酸的含量最低。環(huán)割處理對蔗糖和檸檬酸相關(guān)基因的表達影響顯著，其中環(huán)割處理引起CsSUC1和CsACO1表達量的變化，可能與馬家柚果實中蔗糖和檸檬酸含量變化密切相關(guān)。