褶皺臂尾輪蟲土池大規模培育中酵母維生素替代雞糞的應用效果

朱天，徐世陳，蔡萌，劉洋，韓萃，陳德芝，楊家新*

（1.南京師范大學海洋科學與工程學院，江蘇 南京 210023；2.射陽誠信長江蟹生態育苗場，江蘇 鹽城 224000）

褶皺臂尾輪蟲（）因其體型小，游動緩慢，且能在短時間內進行快速培育，使其成為許多海產經濟動物的開口餌料。自2001年以來，在我國沿海地區，利用雞糞為基肥并結合其他外源物和雞糞追肥培養餌料輪蟲的土池生態育苗模式，已經成為我國河蟹育苗餌料生產的主推模式。輪蟲主要以微藻為食，在底泥中的輪蟲休眠卵受溫度誘導催發后，在合適的微藻密度下，輪蟲的種群密度能夠在較短的時間內快速增長。雞糞因其富含大量氮、磷等生物基本元素，能夠有效地提高池塘的初級生產力，促進微藻的生長。因此，雞糞常常作為輪蟲大規模培育中培育池的主要基肥。然而，由雞糞介導的氮磷輸入易導致水體的富營養化，且在高濃度的氮磷脅迫下，輪蟲的生長與繁殖也會受到負面影響，從而影響輪蟲的產量。因此，需要一種更為清潔、高效的施肥/追肥方式來優化土池培育輪蟲。

通過培養微藻喂養輪蟲的方式，很難在輪蟲大規模培育中支撐起輪蟲的攝食需求，因此需要與其他營養物相結合來實現輪蟲的規?；嘤?。面包酵母富含蛋白質、氨基酸等營養物質，是一種廣泛使用且極具潛力的輪蟲飼料。酵母的含氮量較低，將酵母進行活化后可用于輪蟲的連續培養，且不易造成水體污染。因此，酵母可以作為輪蟲的補充飼料用于投喂，減少培育池內用于培養微藻的雞糞投入量。

此外，在輪蟲大規模生產中，輪蟲達到高峰期后，時常出現“種群崩潰”現象，嚴重影響了輪蟲產量與穩定性。針對這一現象，一些學者認為添加適量的維生素有利于防止輪蟲的種群崩潰，提高輪蟲的產量。目前常用于輪蟲培育的維生素主要有維生素E（V）、維生素C（V）、維生素B12（V）等，維生素與酵母混合投喂能夠有效地使其在輪蟲體內富集?，F參考國內外文獻，選用V、V和V3 種維生素，制定合適的添加量，與酵母制成新型投喂品，對輪蟲培育池追肥，并與使用雞糞追肥的培育方式進行比較，探究酵母維生素在輪蟲培育池實際生產中的應用效果。

1 材料與方法

1.1 池塘

試驗地位于江蘇省鹽城市射陽誠信長江蟹生態育苗場，選擇2 口土塘（PA、PB）作為輪蟲培育池。面積均為7 m×35 m，平均深度均為1.5 m，底質均為黏性土壤。分別在2 口池塘的上風口、下風口和池塘中央設置3 個采樣點。PA 塘、PB 塘的水源均為經過過濾處理的天然海水。使用前對2 口池塘清塘消毒，潑灑質量濃度為30～50 g/m的漂白粉，暴曬2～3 d 后投入使用。其中PA 塘使用維生素和酵母混合物進行追肥，PB 塘使用發酵雞糞追肥。

1.2 酵母維生素混合物

PA 塘、PB 塘均以雞糞為基肥，并人工接種小球藻。PA 塘培育過程中，通過觀察其浮游動物和微藻的種群密度變化，使用酵母維生素混合物追肥1 次。酵母維生素混合物配方：酵母（60 kg/hm，安琪酵母股份有限公司）和水、酵母、紅糖（100∶10∶1）攪拌15 min 后，將其置于陰涼處活化30 min，取上清液與維生素混合。維生素添加量為：V100 g（鄭州中牧飼料有限公司公司生產）、V200 g（強勝飼料有限公司生產）、V200 g（強勝飼料有限公司生產）。PB 塘同日使用發酵雞糞追肥1 次，用量為60 m/hm。

1.3 樣品采集

采樣時間固定為每日08：00，使用13 號、25 號浮游生物網采集輪蟲和浮游植物進行定性定量分析。采集10 L 水樣，過濾濃縮至50 mL，制成混合水樣。水溫（WT）、溶解氧（DO）、pH 值、電導率（Cond）、鹽度（SAL）、葉綠素a（Chl-a）采用多參數YSI 水質分析儀測定和?，攑H 計進行現場測定。使用HACH DR 900 分析儀配合DBR 200 消解器測定水體的銨態氮（NH-N）和總磷（TP）。

1.4 數據處理與分析方法

使用SPSS 21.0、R 軟件進行數據檢驗和池塘環境因子的主成分分析（PCA）。采用單因素方差分析（ANOVA），對輪蟲生命表參數和種群增長參數進行正態分布檢驗和方差齊性檢驗，若數據符合正態分布和方差齊性，則對數據進行單因素方差分析，組間多重比較采用Turkey 檢驗，對于不符合方差齊性的數據，使用Tamhane’s T2 檢驗進行多重比較。使用Origin 2019b 繪圖。

2 結果與分析

2.1 浮游生物

檢測輪蟲培育池的浮游植物種類，有利于分析培育池內輪蟲餌料的組成以及水環境。輪蟲高峰期內，培育池內共檢測出藻類5 門9 種（表1）。輪蟲培育前期（1～4 d），池塘的藻類組成主要以綠藻（小球藻）、硅藻（中華盒形藻、格式圓篩藻）和黃藻（海綠球藻）為主，其中小球藻為人工接種的藻種；培育后期（7～10 d），2 口池塘除小球藻外，裸藻（尖尾裸藻、靜裸藻）出現的頻次較高。

表1 培育池內浮游植物種類和出現頻次①

續表

2.2 輪蟲密度與攜卵率

輪蟲種群密度和攜卵率變化見圖1（a）（b）。PA 塘的輪蟲初始密度（55.25±2.82）ind./mL 與PB塘（55.00±2.47）ind./mL 相近。試驗第2 天，對2口池塘進行追肥，PA 塘輪蟲密度在追肥1 d 后（第3天）明顯增長，輪蟲密度達到峰值（66.5±4.18）ind./mL，此后密度有所下降，在培育期的3～10 d，PA 塘輪蟲密度均顯著高于PB 塘（P<0.05）[圖1（a）]。輪蟲的攜卵率代表了輪蟲種群的繁殖能力，由圖1（b）可見，試驗1～2 d，2 口池塘內輪蟲攜卵率并無顯著差異，而當使用不同肥料進行追肥后，PA 塘的輪蟲攜卵率顯著高于PB 塘（P<0.05），此后5～7 d PA 塘的輪蟲攜卵率顯著高于PB 塘（P<0.05），8～10 d 2 口塘輪蟲攜卵率無顯著差異（P>0.05）。

圖1 輪蟲種群密度和攜卵率變化

2.3 環境因子主成分分析

試驗期間對PA 塘和PB 塘理化因子每日檢測，其變化范圍見表2。使用主成分分析來實現對兩池環境因子的時空變化的可視化。用于解釋主成分的前2 個變量（PC1，PC2）用于繪制二維散點圖，其結果見圖2（a）（b）。PA 塘池塘環境因子[圖2（a）] 的前2 個主成分解釋了總變量的90.88%，PC1 解釋了83.27%，PC2 解釋了7.61%。培育池1～3 d，4～6 d，7～10 d 這3 個階段擁有不同的水環境主成分。其中DO 和NH-N 在PC1 上具有較高的特征值，分別為0.96 和-0.15；Cond、SAL 和NH-N在PC2 上具有較高的絕對特征值，其特征值分別為0.88，0.33 和-0.31。PB 池池塘環境因子[圖2（b）]的前2 個主成分解釋了總變量的88.25%，PC1 解釋了59.27%, PC2 解釋了28.98%。根據圖2（b），可以將培育池的水環境分為1～6 d 和7～9 d 2 個階段，NH-N、DO 和SAL 在PC1 上擁有較高的特征值，分別為-0.73，0.61 和-0.24；NH-N、DO 和Cond 在PC2 上具有較高的特征值，分別為-0.69，-0.67 和0.24。

圖2 環境因子主成分分析

表2 2 口池塘水質環境因子的變化范圍

2.4 輪蟲密度與環境因子相關性分析

通過對輪蟲密度與池塘環境因子之間的相關性分析發現，影響PA 塘輪蟲密度的主要環境因子為pH值、Chl-a 和NH-N，Pearson 相關性系數分別為0.64、-0.72和0.83；影響PB 塘輪蟲密度的主要因子為DO 和TP，其Pearson 相關性系數分別為-0.63 和0.76（表3）。

表3 輪蟲密度與環境因子間相關性分析①

3 討論

隨著中華絨螯蟹集約化育苗產業的擴大，溞狀幼體短期內對輪蟲的集中需求，導致了對生物餌料輪蟲的大量需求。大規模培育輪蟲的過程中，輪蟲的種群密度受到食物濃度、環境因子以及營養水平等多種因素的協同影響。不同的餌料密度會導致不同的輪蟲種群增長；此外，不同水平的鹽度、WT、DO、NH-N 和TP 也會影響輪蟲的種群密度。因此，2 種投喂方式對土池輪蟲培育的影響，應當從多個方面考慮。

雞糞的匯入，能夠為池塘提供大量的氮磷等基本元素，增加水體的初級生產力，從而促進藻類的生長，以供輪蟲攝食。微藻作為輪蟲的基礎餌料，是天然水體中輪蟲的主要食物與營養來源。區別于雞糞施肥促進藻類生長以喂養輪蟲的間接培育方式，酵母可被輪蟲攝食，且含氮量極低，在輪蟲的連續培養中，不易造成水體污染，這2 種施肥方式，也會導致不同的水環境與浮游植物組成結構改變。研究表明，輪蟲具有攝食選擇性，在綠藻、硅藻和裸藻混合的水環境中，輪蟲主要以攝食綠藻（小球藻，微綠球藻等）為主。其中，海水小球藻富含輪蟲所需的各類營養以及豐富的高價不飽和脂肪酸（HUFAs），能夠強化輪蟲的營養價值，被認為是最適合用于培養輪蟲的藻類之一。因此，在土池培育中，小球藻常以人工接種的方式用于投喂輪蟲。該研究的結果中，PB 塘較PA 塘的浮游植物組成更為豐富，而多種藻類共存的水環境不利于單一藻種的生長。因此，使用酵母與維生素進行追肥相比于雞糞追肥，在培育池浮游植物的組成結構上更加有利于培育輪蟲。

小球藻與酵母是培育輪蟲的2 種常見飼料，小球藻用于投喂輪蟲，能夠為輪蟲提供較為全面的營養，而與小球藻相比，酵母缺乏幼苗生長所需的HUFAs，如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等。因此，使用酵母培育輪蟲時，通常需要對輪蟲進行營養強化以滿足幼苗的攝食需求。文獻[9，14-16]研究表明，在輪蟲培育過程中添加V、V、V，能夠提高輪蟲的抗氧化能力，并促進輪蟲種群的增長與繁殖力。Tako研究表明，同時添加維生素和小球藻，能夠有效防止HUFAs 的氧化，增加輪蟲HUFAs 的含量。因此，基于這些學者的研究，選用酵母與維生素進行混合投喂，以求達到更好的輪蟲培育效果。本研究中，輪蟲種群密度的差異始于追肥日（3 d），PA 塘中輪蟲的種群密度于3～10 d 顯著高于PB 塘（P<0.05）；輪蟲攜卵率的顯著差異出現在追肥后的3～6 d，PA塘中輪蟲的攜卵量顯著高于PB 塘（P<0.05），這與預期的結果相一致，PA 塘的輪蟲在產量與繁殖能力上皆顯著高于PB，有效實現了輪蟲增產。

現使用主成分分析（PCA）和Pearson 相關性分析的方法，分析培育池的水環境，揭示2 口池塘中的環境因子變化，以及環境因子與輪蟲產量之間的關系。由PCA 的結果可以得出，2 口池塘1～6 d 的水環境主成分均與NH-N 含量有較高的相關度，而7～10 d 的主成分受DO 的影響較大。PA 塘中輪蟲密度與環境因子間的相關性分析表明（表3），培育期間，PA 塘內的輪蟲密度與NH-N 含量呈顯著正相關（P<0.05）；而PB 塘中NH-N 含量與輪蟲密度的相關性并不顯著（P>0.05），且相關性系數為負值（-0.01），TP 與DO 更多地介導了輪蟲密度的變化。藺麗麗等認為，水體中的NH-N 含量超過5 mg/L，便會對壺狀臂尾輪蟲（Brachionus urceolaris）產生毒害作用，導致輪蟲的種群增長與繁殖力降低。本試驗中，PB 塘中NH-N 的峰值達到了7.12 mg/L（表2），超過了5 mg/L，相關性分析的結果也能夠印證這一觀點。因此，在培育期間，PB 塘水環境中的NH-N 含量對輪蟲種群的增長產生了負面影響，這也是導致PB 塘輪蟲種群密度低于PA 塘的原因之一。綜上所述，在以雞糞為基肥與追肥的輪蟲土池大規模培育中，使用酵母維生素混合物追肥代替雞糞追肥的方式，能夠使培育池擁有更好的水環境。該方法能夠減少一半雞糞的投入量，從源頭減少氮磷的匯入。此外，從生物防治污染的角度來說，更高的輪蟲產量，也代表能夠以生物的方式實現氮磷等基本營養元素的固定，并從水體中移出，防止更多的營養物流入天然水域，有效緩解輪蟲培育池帶來的尾水污染。

4 結語

褶皺臂尾輪蟲（B.plicatilis）大規模土池粗放式培育中，使用酵母維生素混合物追肥與直接使用雞糞追肥的方式相比，酵母維生素混合物方式有利于培育池內餌料微藻的培養，提高輪蟲密度與繁殖能力，增加了輪蟲產量。此方法減少了一半的雞糞投入量，能夠在輪蟲培育池內維持更好的水環境，有效降低輪蟲培育帶來的污染，操作簡易，適合在沿海生物餌料生產企業中進行推廣。