炎癥因素在糖尿病性黃斑水腫中的作用及展望

秦時月，徐國旭，張敬法

0引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)是工作人群視力受損或下降的主要原因，其中糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)和增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative DR, PDR)是導致患者視力損害的主要原因，患病率分別為23.0%和14.0%[1]。DME是DR最常見的并發癥，研究顯示若不進行干預治療，約25%～30%的DR患者3a內將發生具有臨床意義的黃斑水腫，導致患者視功能受到嚴重損害。目前，DME具體發病機制尚未完全闡明，血-視網膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)功能受損或破壞所致的滲漏增加是導致DME的主要原因。近年研究表明，炎癥因素也參與了疾病的發生與發展[2]。本文旨在闡述炎癥因素在DME中作用及機制，以期探究抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和抗炎治療在DME中的潛在價值。

1炎癥細胞的活化

在DME發病機制中，慢性高血糖激活多條生化途徑，如蛋白激酶C(PKC)通路、晚期糖基化終末產物(AGEs)增多、多元醇通路、氨基己糖通路、腎素血管緊張系統、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶活化等[3-4]，導致視網膜缺氧、氧化應激和慢性炎癥。小膠質細胞、單核/巨噬細胞、Müller細胞和視網膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)細胞等炎癥相關細胞活化，釋放大量的炎癥因子及炎癥介質，包括補體系統、VEGF、胎盤生長因子(placental growth factor，PlGF)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-1β、IL-6及IL-8等[5]，導致血-視網膜屏障破壞。此外，視網膜血管內皮細胞通過上調細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)及血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)表達，導致白細胞黏附和瘀滯(leukostasis)，進一步加重視網膜缺氧以及血-視網膜屏障的破壞。

1.1小膠質細胞及單核-巨噬細胞活化小膠質細胞是視網膜中主要的常駐免疫細胞，參與維持視網膜內環境的穩定。一旦視網膜內環境穩態改變，小膠質細胞和單核-巨噬細胞會活化。慢性高血糖和炎癥可招募和誘導巨噬細胞和小膠質細胞活化[6-8]。活化的小膠質細胞和單核-巨噬細胞遷移到病變區域，吞噬受損或死亡細胞，導致RPE功能改變，并釋放炎癥因子[9-10]，如VEGF、PlGF、TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8等，并減少視網膜血管附近抗炎介質的產生，加重血-視網膜屏障的破壞[11-13]。在糖尿病大鼠視網膜中，趨化因子配體2/單核細胞趨化蛋白-1[chemokine(C-C motif)ligand 2/monocyte chemotactic protein-1，CCL2/MCP-1]水平升高，招募單核-巨噬細胞浸潤[14]。CCL2主要是由小膠質細胞分泌；此外，來源于小膠質細胞的IL-1β也可以誘導視網膜Müller細胞和RPE細胞分泌CCL2[15]。

近年來，光學相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)檢測到的視網膜內高反射點(hyper reflective foci，HRF)被認為是預測眼底疾病進展、療效及預后的新型生物標志物。關于HRF的起源還存在一些爭議，有研究認為HRF來源于視網膜內外滲蛋白和/或脂質沉積，被認為是硬性滲出的前體[16]。還有研究認為HRF是血-視網膜屏障破壞的結果，即含脂巨噬細胞遷移到視網膜內[17]。隨著血管OCT(OCTA)的廣泛應用，近年來HRF被認為可能來源于視網膜內活化的炎癥細胞，特別是小膠質細胞和巨噬細胞。活化的小膠質細胞胞體變大，細胞形態呈“阿米巴樣”，在OCT中呈現高反射點表現。HRF可見于多種視網膜疾病，包括DR、DME、視網膜靜脈阻塞、無脈絡膜癥、以及其他視網膜退行性疾病[18-20]。在DME患者的OCTA檢查中，我們發現視網膜內HRF數量明顯增多，主要聚集在視網膜囊樣水腫以及網膜下積液的周圍，甚至出現在視網膜外層，提示炎癥細胞參與了DME的發生與發展(圖1)[21]。

圖1 DME患者OCTA掃描檢測視網膜內HRF(黃色箭頭) A:病例1，男，70歲，視網膜內層間積液及視網膜下積液周圍出現HRF;B:病例2，女，61歲，視網膜全層及囊樣水腫周圍出現HRF。

1.2白細胞瘀滯在DME發病機制中，慢性高血糖、氧化應激和升高的VEGF等因素通過上調血管內皮細胞表達ICAM-1誘導單核細胞和白細胞附著到血管壁上并導致白細胞瘀滯(leukostasis)[22-24]。白細胞黏附和瘀滯通常伴隨著血-視網膜屏障功能障礙[25-26]。黏附的白細胞還可產生氧自由基、蛋白水解酶及各種炎性因子，進一步加重視網膜血管內皮細胞損傷和血-視網膜屏障破壞[27-28]，加重黃斑水腫。采用ICAM-1和CD18中和抗體可抑制白細胞黏附和視網膜血管內皮細胞死亡[29]，表明白細胞黏附是導致視網膜血管內皮細胞的死亡和血-視網膜屏障功能障礙的重要原因。

1.3視網膜Müller細胞活化Müller細胞作為視網膜內的大膠質細胞，主要通過內向整流鉀離子通道(inwardly-rectifying potassium channel, Kir)，特別是Kir4.1和水通道蛋白4(Aquaporin 4, AQP4)[30]，將視網膜內的液體和離子排出至視網膜血管或玻璃體腔內，使視網膜處于“相對干”的狀態，從而維持視網膜水和離子穩態。任何視網膜應激都可激活RMG，并改變RMG細胞中Kir和AQP4的表達和分布，導致Müller細胞引流功能障礙。此外，Müller細胞也是VEGF的主要來源[31]。活化的Müller細胞分泌VEGF、IL-6和MCP-1[32-33]等炎癥因子和趨化因子[34]，加重視網膜炎癥反應以及血-視網膜屏障破壞。此外，Kir和水通道的異常以及細胞內離子的蓄積還會引起Müller細胞的滲透性水腫(亦稱為“細胞毒性水腫或細胞性水腫”)，導致Müller細胞排水功能障礙并形成囊樣水腫，從而加重黃斑水腫[35]。

臨床上，通過OCTA檢查，部分DME患者會出現囊樣水腫(圖2)，提示Müller細胞性水腫。在DR中，Müller細胞的Kir4.1分布發生改變，導致視網膜深層血管周圍的Kir4.1通道丟失。由于視網膜深層血管中星形膠質細胞缺失，Müller細胞是與視網膜深層血管相互作用的唯一大膠質細胞36，這導致液體積聚在視網膜內核層37，形成囊樣水腫。因此，視網膜內囊樣水腫通常反映在慢性高血糖和炎癥的持續刺激下Müller細胞引流功能障礙，并隨病變進展導致Müller細胞性水腫或囊樣變性。

圖2 DME患者OCTA檢查en-face及B掃描均顯示視網膜深層毛細血管層存在大量囊樣水腫(黃色星號) A:病例3，男，50歲；B:病例4，女，77歲。

1.4RPE細胞功能障礙RPE除了作為血-視網膜外屏障的重要組成外，還在外層視網膜，尤其是視網膜下液的穩態維持中發揮著重要作用。RPE可被炎癥激活，并產生大量的炎性細胞因子和趨化因子，與脈絡膜巨噬細胞/小膠質細胞和肥大細胞密切相互作用。視網膜下小膠質細胞的聚集和激活可促進RPE細胞產生促炎介質，進一步加重炎癥級聯反應[38]和血-視網膜外屏障的破壞[39]。

在部分DME患者中，通過OCT檢測可以發現由血-視網膜外屏障破壞或RPE功能障礙導致的視網膜下積液(subretinal fluid，SRF)積聚或中心凹下神經視網膜脫離(subfoveal neuroretinal detachment，SND)(圖3)。橫斷面、前瞻性、病例對照研究表明DME合并SND中HRF數量顯著高于無SND的患者[40]；此外，回顧性研究發現DME合并SND的患者玻璃體內炎癥因子，如IL-6、IL-8表達較非SND患者顯著升高[41]，提示炎癥細胞和炎癥因子參與了SND型DME的發病。

圖3 DME患者OCTA檢查B掃描均顯示黃斑中心凹下SRF(白色雙箭頭) A:病例5，男，50歲；B：病例6，男，62歲。

作為高度極化的上皮細胞，任何視網膜應激，如糖尿病、炎癥，不僅會改變RPE細胞的緊密連接，導致血-視網膜外屏障的破壞；還會導致RPE細胞膜轉運體的異常分布，導致RPE細胞引流功能障礙，共同導致SRF形成。DR時，RPE細胞間緊密連接減少[42]，水通道蛋白表達模式改變[43]。水通道蛋白對RPE細胞的排水功能至關重要。在缺氧、氧化應激、VEGF和高糖條件下，AQP9在體外培養的RPE細胞中高表達[44]。在鏈脲佐菌素誘導的1型糖尿病模型中，AQP5、AQP9、AQP11和AQP12在RPE中高表達，而AQP0降低[43]。

綜上所述，DME時，多種因素誘導視網膜RMG和RPE細胞活化和功能改變，導致RMG和RPE細胞中水和離子通道的表達和分布異常及排水功能障礙，加重DME。

2炎性因子和炎性介質大量生成和釋放

在DME患者的房水或玻璃體中，檢測到大量炎性因子和炎性介質，如補體、IL-1β、IL-6、IL-8、VEGF、PlGF、TNF-α、MCP-1、ICAM-1、TGF-β等表達增加，提示炎性因子和炎性介質可誘發炎癥反應，加重血-視網膜屏障破壞，參與了DME的發生與發展[45-46]。

2.1VEGF家族以及VEGF受體在DME中的作用VEGF家族成員包括VEGF-A、B、C、D和PlGF，其中VEGF-A與眼部血管性疾病密切相關，可由多種視網膜細胞，如RMG細胞、內皮細胞、RPE細胞、周細胞和星形膠質細胞等產生，這些細胞在高血糖、缺氧[47]、年齡和炎性細胞因子如IL-1β、IL-6等[46]刺激下，上調視網膜內VEGF-A及其他家族成員的表達。VEGF-A通過與VEGF受體(VEGFR-1和VEGFR-2)結合，發揮細胞效應，在血管滲漏、新生血管生成和炎癥反應中發揮關鍵作用[48]。VEGFR-1主要由單核細胞和巨噬細胞表達，與VEGF-A和PlGF特異性結合，刺激炎癥因子的產生和單核-巨噬細胞的趨化，在炎癥、缺血和癌癥等疾病中起關鍵作用[45]。VEGFR-2主要由血管內皮細胞表達，不僅可以增加血管通透性，還可以通過核因子κB(NF-κB)來調節炎癥因子(如MCP-1和ICAM-1)的表達[45]。這表明，除了增加血管通透性外，VEGF還可以直接促進炎癥和視網膜內皮細胞的增殖、白細胞黏附和瘀滯。因此，VEGF-A在DME的發病機制中扮演著重要而復雜的角色。

PlGF作為VEGFR-1的主要配體，其同源二聚體僅與VEGFR-1結合。PlGF可有效地促進血管生成，并誘導內皮細胞的生長和遷移[45]。與VEGF-A相似，PlGF還通過刺激單核細胞和巨噬細胞產生炎癥因子和趨化因子來調節炎癥過程[45]。由于PlGF與VEGFR-1的親和力高于VEGF-A，因此過量的PlGF可通過結合VEGFR-1置換出已經與受體結合的VEGF-A，參與眼底病變的發生；而置換出的VEGF-A可通過與VEGF-R2結合發揮病理性作用。此外，單體形式的PlGF和VEGF-A可形成異源二聚體，通過與VEGFR-1/VEGFR-2異源二聚體受體結合發揮病理性作用。有研究發現房水中的PlGF水平與DME的嚴重程度顯著相關[49]，綜上所述，這些發現表明PlGF參與了DME患者黃斑水腫的發病。

2.2補體系統補體系統在黃斑水腫中發揮重要作用，機制與其激活狀態有關。例如，C1抑制劑是激肽誘導滲透性的重要調節因子。過敏毒素C3a和C5a通過促使脈絡膜中肥大細胞脫顆粒來誘導血管高通透性。此外，C5a通過PI3K和Src激酶途徑導致血管內皮細胞收縮并增加細胞旁路的通透性[50]。

2.3TNF-α TNF-α是一種促炎細胞因子，由小膠質細胞、RMG細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和T細胞在各種刺激下產生[46]。TNF-α具有多種生物學效應，包括上調黏附分子、增殖、分化和細胞死亡，被認為與DR病變和眼內炎癥等密切相關。大量體內外研究表明，在DR病變中，TNF-α主要通過刺激巨噬細胞、小膠質細胞以及其他細胞產生炎性因子，如IL-6、IL-8和TNF-α，增強炎癥反應。另一方面，TNF-α可通過激活腫瘤壞死因子受體-1(TNFR-1)和PKCδ/JNK1/2/c-Jun通路誘導ICAM-1的表達，促進白細胞黏附[51]，誘導內皮細胞死亡，還可以增加RPE的通透性[46]，導致血-視網膜屏障破壞，加重視網膜滲漏和黃斑水腫。

2.4IL-1β IL-1β是一種主要的促炎細胞因子，通常在應對感染、組織損傷或免疫攻擊時由單核/巨噬細胞等免疫細胞產生[52]。以往的報道表明，IL-1β可引起視網膜的多種改變，包括白細胞募集、血管通透性增加以及內皮細胞形態和功能的改變[46]，進一步破壞血-視網膜屏障，加重視網膜血管滲漏，加重視網膜水腫。IL-1β通過JNK和p38MAPK通路激活NF-κB，促進炎性相關因子和促炎因子的表達，如IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α等[46]，導致視網膜炎性反應。

2.5IL-6 IL-6在宿主抵抗環境壓力(如感染和組織損傷)中起著關鍵作用，在刺激下迅速由單核細胞、巨噬細胞和小膠質細胞產生[53]，可刺激成纖維細胞、內皮細胞和巨噬細胞產生凝血因子來維持炎癥，隨后更多的中性粒細胞和巨噬細胞被募集到視網膜，從而導致組織損傷和慢性炎癥的持續[46]。IL-6還可直接破壞內皮細胞和上皮細胞的屏障作用，或者通過誘導其他細胞因子和生長因子的產生來增加血管的通透性[54-55]，是VEGF介導血管滲漏的重要介質，在DME和其他炎癥性眼病的發病機制中起著重要作用[56]。在DME合并SND患者中，玻璃體中IL-6高表達，多元回歸分析表明IL-6與SND型DME具有正相關[41]。

2.6IL-8 IL-8是一種促炎趨化因子，通過激活中性粒細胞和T細胞來促進炎癥反應，也是新生血管的重要介體。IL-8在DME的發生中起著重要作用，可誘導中性粒細胞和單核細胞聚集[46]，此外，IL-8可下調血管內皮細胞間緊密連接蛋白，包括occludin、claudin-5和ZO-1[50]，從而增加血管通透性[45]，加重黃斑水腫。有研究表明IL-1β可通過p38 MAPK和ERK1/2信號轉導通路刺激RMG細胞表達IL-8，進一步增強IL-1β在DR病變中的致病作用[33]，這說明在DR炎癥反應過程中，不同細胞因子和趨化因子之間存在顯著的重疊和相互作用(crosstalk)。

2.7ICAM-1 ICAM-1是一種黏附分子，在視網膜和脈絡膜中表達。視網膜缺氧上調ICAM-1的表達[57]，ICAM-1通過與白細胞表面的整合素受體結合促進白細胞黏附和瘀滯。ICAM-1介導的白細胞黏附和瘀滯會加重視網膜缺氧和視網膜血管內皮細胞損傷，從而加重血-視網膜屏障的破壞[50]。

3 DME的治療

DME的發病機制非常復雜，既包括血-視網膜屏障破壞所致的滲漏增加，又包括RMG和RPE細胞功能障礙所致的引流功能減弱。除此之外，炎癥因素在DME中也發揮著重要作用，涉及多條生化途徑和多種細胞因子，如VEGF、PlGF、炎性相關因子等。

抗VEGF藥物的問世使DME的治療發生了革命性的變化，被認為是當前DME的一線治療藥物。抗VEGF治療主要通過拮抗VEGF和/或PlGF從而減少上述因子對黃斑水腫的促進作用。大規模的臨床試驗如RIDE/RISE、DRCR.net Protocol Ⅰ & T和VIVID/VISTA等均顯示DME患者經抗VEGF治療后，視力得到顯著改善且黃斑水腫明顯減退。

然而，即使經過規范的抗VEGF治療，只有33%～45%的患者視力有3行或3行以上的改善，大部分DME患者表現為中度應答(5～9個字母改善)或較差的應答(<5個字母改善或更差)[58]。這表明DME發病機制復雜，多種因素參與了其發生與發展。部分患者對抗VEGF藥物反應差甚至抵抗的原因可能是由于抗VEGF藥物無法靶向除VEGF以外的其他因素導致的病變，如炎性細胞和炎癥因子的參與。對于這類患者，可以考慮眼內注射地塞米松玻璃體內植入劑。眼內注射地塞米松玻璃體內植入劑既可以抑制多種炎癥細胞，包括小膠質細胞、巨噬細胞、淋巴細胞及視網膜血管內皮細胞，還可以抑制多種炎性因子，如VEGF、PlGF、IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α，從而發揮強大的抗炎效果。

近年來，隨著對DR和DME發病機制認識的不斷深入，針對新的靶點的藥物實驗也正在臨床前研究和臨床試驗階段進行檢測和驗證中。

Faricimab是雙特異性抗體，通過阻斷Ang-2和VEGF-A兩條途徑來治療多種視網膜血管性疾病。兩項針對DME的隨機、雙盲、多中心、非劣效的全球Ⅲ期臨床試驗(YOSEMITE和RHINE)表明DME患者經faricimab眼內注射后獲得了顯著的視力提升和解剖學獲益，最長治療間隔可達16wk。兩項臨床試驗結果均達到其主要終點指標，顯示與當前每2mo給藥一次的標準治療方案相比，每4mo給藥一次faricimab也可達到非劣效性標準的視力獲益[59]。血管內皮蛋白酪氨酸磷酸酶(VE-PTP)是一種內皮細胞特異性受體酪氨酸磷酸酶，可使Tie2失活并抑制其細胞內信號通路。一項Ⅰ期研究表明，DME患者皮下注射VE-PTP競爭性抑制劑可減少黃斑水腫并改善部分患者的視力[60]。趨化因子受體2和5(CCR2/5)位于單核細胞表面，可誘導炎癥細胞到達靶組織。在最近的一項Ⅱ期試驗中，口服CCR2/5趨化因子受體雙拮抗劑可改善部分DME患者視力，但療效低于玻璃體腔內注射雷珠單抗[61]。一項小型Ⅲ期研究表明，與安慰劑相比，靜脈注射英夫利昔單抗(抗TNF-α單克隆抗體)能顯著改善DME患者的視力；但對頑固性DME，拮抗TNF-α可能會引起嚴重的眼內炎癥反應[62]。靶向IL-6及其受體的臨床研究也在開展中，旨在評估IL-6及其受體的抑制在眼底血管性疾病中的療效[63]。血管黏附蛋白(VAP)-1是一種類似于ICAM-1的內皮黏附分子。在一項Ⅱ期臨床研究中，比較了口服VAP-1抑制劑ASP8232(Astellas, Northbrook, IL, USA)與玻璃體腔注射雷珠單抗對DME患者的療效[64]。然而，盡管ASP8232幾乎完全抑制了血漿中VAP-1的活性，但對DME未見明顯改善，且聯合治療與單用雷珠單抗相比沒有優勢。針對新靶點的研發有望為DME治療提供更具針對性的靶向治療措施。

當病情加重或復雜時，需考慮綜合治療方案，如積極控制血糖，眼內注射抗VEGF藥物、緩釋地塞米松植入物、激光光凝、微脈沖、甚至玻璃體切割術等，最大程度的促進黃斑水腫的吸收。

4總結

盡管目前有各種有效的治療方法，但DME仍然是工作人群中最常見的致盲原因，因此是一個重大的社會經濟負擔。DME的發病機制非常復雜，且多因素參與，如血-視網膜屏障破壞、RMG和RPE細胞引流功能障礙、微血管瘤的滲漏、玻璃體黃斑界面因素、玻璃體炎性儲庫作用，以及炎性因素等。近年研究表明，炎癥因素在DME中發揮關鍵作用，大量的炎癥細胞活化和炎癥因子釋放，導致血-視網膜屏障功能受損，引起視網膜血管通透性增加，甚至刺激RMG和RPE細胞導致細胞引流功能障礙，形成并加重黃斑水腫(圖4)。基于這些機制，目前眼內注射抗VEGF藥物和抗炎藥物(如緩釋地塞米松植入物)是DME的主要治療手段。但是DME患者需要頻繁的玻璃體腔注射，而且仍然有相當數量的患者對抗VEGF藥物和激素治療反應不佳。因此，我們需要對DME的發病機制進行更深入的研究，從而研發更精確的靶向治療藥物。比如對全身和玻璃體的生物標記物(microRNAs、蛋白質組學、代謝組學等)的更多研究可能有助于發現其他適用于藥物開發的新靶點。此外，通過對DME患者眼內液，如房水或玻璃體液，進行檢測和分析，明確主要的致病因子或組合，從而進行更個性化的精準醫療。因此，提高對DME發病機制的認識和理解，尋找新的治療策略，將是預防和干預DME的關鍵。

圖4 DME發病機制 慢性高血糖激活不同的生化途徑，導致視網膜缺氧、氧化應激和慢性炎癥反應。炎癥細胞激活，炎癥因子和炎癥介質大量釋放，導致血-視網膜屏障破壞，從而導致DME。