EGCG誘導人視網膜色素上皮細胞凋亡作用的研究

邱梅園，丁芝祥，靳 荷，蔣姣姣

0引言

視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞是視網膜神經細胞和脈絡膜之間的單層上皮細胞層，對視網膜的內在平衡至關重要。它構成了視網膜生物屏障，對神經視網膜的光感受器有支持作用，此外也具有運輸營養物質及免疫赦免等功能[1]。因此，RPE的異常變化會引起其功能紊亂，導致光感受器的退化及視力的喪失，最終導致增殖性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy, PVR)或年齡相關性黃斑變性等疾病的發生。PVR是視網膜脫離的并發癥之一，其主要原因是由于RPE細胞、巨噬細胞和纖維母細胞等的大量增殖，其中RPE細胞的增殖被認為是PVR發生發展最主要的原因，RPE細胞異常增生使其遷移至玻璃體腔和玻璃體視網膜交界處，逐漸形成視網膜前膜，進而牽拉視網膜，最終導致視網膜脫離及視力損害。此外，在PVR發展之前，RPE細胞異常增殖及遷移的相關表型也難以回到正常狀態。因此，如何控制PVR的發展仍是一個難題。近年來，PVR的研究熱點是借助細胞凋亡途徑控制RPE細胞的增殖，或施加凋亡誘導劑，使增殖及遷移的細胞發生凋亡，進而遏制PVR的進展。綠茶多酚提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是綠茶多酚提取物兒茶素(catechin)的主要成分，約占兒茶素的80%，具有很強的抗氧化能力。同時，研究表明低濃度EGCG對紫外線等因素引起的RPE細胞凋亡具有抵抗作用。而EGCG單獨使用對RPE細胞起到什么作用尚不清楚。本實驗應用不同濃度EGCG作用于體外培養的人視網膜色素上皮細胞(ARPE-19)，探討EGCG對RPE細胞的促/抗凋亡作用，并觀察其對凋亡相關因子B淋巴細胞瘤-2基因(bcl-2)、BCL2-Associated X的蛋白質(Bax)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)等因子的mRNA及蛋白水平的影響，評價EGCG對PVR早期防治的應用價值。

1材料和方法

1.1材料EGCG(中國藥品生物制品檢定所)；ARPE-19株購買于武漢大學細胞庫中國典型培養物保藏中心(武漢);青鏈霉素混合液(100×)(含青霉素10U/L，含鏈霉素10μg/L)購自武漢博士德生物公司;DMEM培養基、小牛血清和胰蛋白酶均購自GIBCO公司;鼠抗β-actin單克隆抗體(上海碧云天);兔抗bcl-2、caspase-3、p53多克隆體(abcam公司)；兔抗Bax多克隆抗體(abmart)、ECL試劑盒(美國伯樂公司)。Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)，蛋白定量分析試劑盒(上海碧云天生物有限公司)。流式細胞儀(美國BD FACScan)；倒置熒光顯微鏡IX-71(日本Olympus公司)；細胞培養箱(美國thermo公司)；冷凍高速離心機(美國thermo公司)，蛋白電泳及轉印系統(美國伯樂公司)，酶標儀(瑞士TECAN公司)。

1.2方法

1.2.1EGCG溶液配制將EGCG用PBS配制成16mg/mL的母液，0.22μm的濾膜過濾除菌，用完全培養基稀釋成40、80、160μg/mL三個濃度。

1.2.2ARPE-19細胞株培養調整密度為每毫升5×104個細胞接種到培養瓶中，在37℃，5%CO2條件下常規培養，培養基為含10%胎牛血清、青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100μg/mL)的DMEM培養基。

1.2.3hoechst33258熒光染色取對數生長期的ARPE-19，以每孔4×104個細胞種于6孔板內，EGCG干預48h后，將6孔板內的培養基吸出，PBS洗兩遍，4%的多聚甲醛室溫固定15min，PBS洗兩遍后，加入用PBS(1∶1 000)稀釋hoechst 33258，37℃孵育20min。PBS洗兩遍后，熒光顯微鏡下觀察拍照，注意操作時動作輕柔，以免凋亡細胞被洗掉。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率EGCG處理細胞48h后，胰酶消化收集細胞，PBS洗滌后離心，轉移到1.5mL EP管內，先將10×結合緩沖液用去離子水稀釋成1×結合緩沖液，每管加100μL稀釋好的結合緩沖液，各加入5μL Annexin V-FITC和PI，室溫避光染色30min，再加入100μL稀釋好的結合緩沖液，篩網過濾，流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測細胞Bax和caspase-3及p53的mRNA表達EGCG處理細胞48h后收集細胞，PBS洗滌，加入Trizol試劑，提取總RNA，鑒定RNA純度和濃度，按RNA試劑盒要求依次加入試劑，將總RNA逆轉錄成cDNA，后按熒光定量擴增試劑盒要求依次加入引物和反應試劑，ABI7500fast熒光定量PCR儀上機檢測，反應條件:50℃ 2min，94℃ 15min；94℃ 15s，60℃ 1min(采集熒光)，40個循環。將β-actin設為內參，正常組設為1，以p53，Bax，caspase-3的2-ΔΔCt反映目的基因mRNA相對表達水平。

1.2.6Westernblot法檢測細胞蛋白表達收集EGCG處理48h后的細胞，PBS洗2次，加入細胞裂解液，提取總蛋白，離心取上清，BCA方法測定蛋白濃度。SDS-PAGE膠電泳后，將蛋白轉移至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入bcl-2、Bax、caspase-3和p53的一抗(1∶1 000)孵育過夜，加入稀釋合適濃度的二抗，室溫孵育反應后洗膜，膠片發光顯影后定影掃描。以β-actin作為內參，用目的蛋白灰度值/內參灰度值反映蛋白的相對表達水平，實驗重復3次。

2結果

2.1hoechst33258熒光染色hoechst 33258染色觀察是否有凋亡小體的出現，結果發現隨著EGCG濃度的升高，凋亡細胞也逐漸增多，熒光染色變高亮濃縮，并可見明顯的凋亡小體，見圖1。

圖1 hoechst 33258熒光染色分析不同濃度EGCG誘導ARPE-19內的凋亡小體 箭頭所示凋亡小體。

2.2流式細胞儀檢測不同濃度EGCG誘導ARPE-19凋亡情況不同濃度EGCG組間凋亡率比較差異有統計學意義(F=168.409，P<0.01)，見表1。組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗，80、160μg/mL組與對照組和40μg/mL組比較差異均有統計學意義(P<0.01)，80μg/mL組與160μg/mL組比較差異有統計學意義(P<0.01)，40μg/mL組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測不同濃度EGCG誘導ARPE-19凋亡情況 bP<0.01 vs對照組; dP<0.01 vs 40μg/mL。

2.3實時熒光定量PCR檢測不同濃度EGCG凋亡相關因子的mRNA表達不同濃度EGCG處理ARPE-19后，能夠顯著上調p53，Bax和caspase-3 mRNA的表達。不同濃度EGCG各組間Bax、caspase-3、p53的mRNA表達比較差異均有統計學意義(P<0.05)，兩兩比較結果見表1，圖3。

圖3 實時熒光定量PCR分析不同濃度EGCG凋亡相關因子的mRNA表達 A:Bax;B:caspase-3;C:p53；aP<0.05, bP<0.01 vs對照組。

2.4Westernblot檢測不同濃度EGCG凋亡相關蛋白的表達EGCG作用ARPE-19 48h后，Western blot檢測bcl-2、Bax、caspase-3和p53的蛋白表達情況，隨著劑量的增加，EGCG可明顯抑制bcl-2的蛋白表達，而顯著增強Bax，caspase-3和p53的蛋白表達，見圖4。不同濃度EGCG各組間bcl-2、Bax、caspase-3和p53的蛋白表達比較差異均有統計學意義(P<0.01)，兩兩比較結果見表1。

圖4 Western blot檢測不同濃度EGCG凋亡相關因子蛋白表達 A:bcl-2;B:Bax;C:caspase-3;D:p53。bP<0.01 vs對照組。

表1 各組凋亡率和各因子mRNA及蛋白表達比較

3討論

PVR是孔源性視網膜脫離最嚴重的并發癥之一，易造成視網膜結構的變形以及視網膜復位手術的失敗，嚴重的可以導致視功能喪失或失明[2]。RPE細胞是PVR發生發展中公認的最重要的細胞成分，RPE是視網膜10層結構的最外層，構成了視網膜的外屏障。正常情況下，RPE細胞是靜止的，但是若在受損傷的情況下可發生增殖和遷移，是PVR惡化的原因之一，因此早期抑制RPE細胞的增殖成為近年來PVR防治研究的主流趨勢和熱點。目前，臨床上尚沒有療效確切的藥物用于PVR的治療，各種抗增殖、抗代謝的藥物因毒性大、副作用多等問題限制了其進一步的臨床應用[3-4]，目前這類藥物尚處于實驗研究階段[5]，因此，尋求新的治療PVR的途徑提上日程，成為當前研究的熱點。EGCG是綠茶多酚提取物兒茶素的主要成分，約占兒茶素的80%，具有特殊的立體化學結構[6]。大量研究表明茶多酚具有很強的抗氧化能力，一直作為天然的食品抗氧化添加劑，具有抗氧化、抗腫瘤[7-8]、清除氧自由基等多種生物活性作用，有良好的應用前景[9]。誘導RPE細胞凋亡能夠很好的抑制細胞的增殖及轉移[10]，Cao等[11]利用50μmol/L(約23μg/mL)濃度的EGCG作用于受到紫外線處理的RPE細胞，結果表明該濃度的EGCG對紫外線引起的RPE細胞凋亡具有保護作用，該實驗中僅用了一個濃度。但其他濃度或更高濃度的EGCG單獨使用對RPE細胞是否具有不同的作用尚不清楚。本文利用40、80、160μg/mL的EGCG單獨作用于體外培養的ARPE-19[12]，檢測了細胞凋亡相關的指標，目的是全面了解EGCG對ARPE-19的作用。

EGCG作用ARPE-19 48h，普通顯微鏡下觀察發現隨著藥物溶度的增高，ARPE-19數量逐漸減少，并且變圓，乃至細胞從培養皿上脫落下來，為了證實細胞是壞死還是凋亡，我們利用hoechst 33258進行染色，發現使用的160μg/mL的EGCG能誘導ARPE-19的凋亡小體出現，說明160μg/mL的EGCG能夠誘導ARPE-19發生凋亡，流式細胞儀進一步分析表明，160μg/mL EGCG能夠誘導21%左右的ARPE-19發生凋亡。細胞凋亡的發生，往往伴隨著促凋亡因子表達的增多以及抑制凋亡因子表達的減少[13-15]。caspase-3、Bax和p53是屬于促凋亡細胞因子，當凋亡發生時，常常伴隨著這些因子表達的升高[16-18]。Bcl-2細胞因子是屬于bcl-2家族的一員，與細胞凋亡密切相關，是一種非常重要的抑制凋亡的細胞因子[16, 19]。本研究發現，80和160μg/mL的EGCG干預ARPE-19后，也伴隨著caspase-3、Bax、p53和Bcl-2的表達改變。實時熒光定量PCR及Western blot實驗結果顯示，隨著EGCG濃度的增高，促凋亡因子caspase-3、Bax和p53的表達增多，而抑制凋亡因子bcl-2的表達減少，這說明80和160μg/mL的EGCG在誘導ARPE-19發生凋亡的同時，上調caspase-3、Bax和p53的表達，下調bcl-2的表達，EGCG誘導ARPE-19凋亡的機制與caspase-3、Bax，p53和bcl-2等細胞因子的表達改變有關。

上述結果表明80和160μg/mL的EGCG具有促進ARPE-19凋亡作用，有望用于抑制因RPE細胞異常增殖引起的PVR病變。但仍然有諸多問題需要進一步研究。比如，該濃度EGCG對其他細胞，尤其是視網膜內的其他細胞是否具有促凋亡作用。如果EGCG對其他細胞也具有促凋亡作用，其應用就受到極大的限制。需要進一步檢測恰當的濃度，使得該濃度EGCG只引起RPE細胞凋亡，而對其他細胞沒有影響，這樣才具有臨床應用價值。由于EGCG是一種多靶點的抑制劑，其對RPE細胞的作用機制及靶點還遠未完全闡明，這些細胞因子之間的上下游關系以及相互聯系如何尚需進行更深入的研究。