牦牛乳對實驗室常用大腸桿菌菌株生長的影響

粟雨芯，李方琳，田曉靜，喬自林，李 倬，馬忠仁*

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

牦牛乳又稱“天然濃縮乳”，富含脂肪、必需礦物質(zhì)和健康的多不飽和脂肪酸，如共軛亞油酸和Omega-3脂肪酸[1]，在牧民的日常飲食中占有重要地位。目前牦牛奶對基因工程菌的增殖影響還沒有研究。大腸桿菌是人和動物腸道中的常見菌群，幫助宿主消化攝入的碳水化合物等食物，其在腸道中豐度的高低會影響宿主健康。研究表明，腸道菌群與宿主健康有密切關(guān)系，如在營養(yǎng)吸收、病原體防御等方面[2-3]。腸道微生物菌群的變化和失調(diào)與全體性炎癥和代謝綜合征密切相關(guān)[4-5]。如肥胖患者腸道微生態(tài)失衡嚴重，主要表現(xiàn)為微生物多樣性下降，結(jié)構(gòu)偏差，擬桿菌門與厚壁菌門比例低[6]。大腸桿菌BL21和DH5α是實驗室最常用的基因工程菌，具有迅速繁殖、生長、大規(guī)模培養(yǎng)的特點。因此，本試驗以牦牛乳為研究對象，研究其對實驗室常用大腸桿菌在體外培養(yǎng)條件下生長的影響，為進一步研究牦牛乳對人體腸道微生態(tài)的影響提供前期數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1材料與試劑 牦牛奶：采自甘肅省甘南藏族自治州瑪曲縣歐拉秀瑪鄉(xiāng)某農(nóng)戶，經(jīng)八層紗布過濾后運往實驗室，凍干成塊狀后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

菌株：大腸桿菌DH5α和BL21及pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心實驗室保存。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸出粉5 g/L、NaCl 10 g/L。LB固體培養(yǎng)基需加入2.0%瓊脂粉。氨芐青霉素（100 μg/ml）。

1.1.2主要儀器設(shè)備YXQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），酶標儀（Thermo Scientific），SW-CJ-1CU超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），pH計（上海三信），ZYW-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1牦牛乳稀釋液制備 稱取制備的凍干奶粉溶于純水中，配得25 mg/ml濃度的奶液，用0.22 μm濾膜過濾后，保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2重組大腸桿菌構(gòu)建和感受態(tài)的培養(yǎng) 分別取1 μl pcDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至100 μl E.coli DH5α和BL21感受態(tài)細胞，冰上靜置30 min，42 ℃水浴90 s后冰上靜置5 min，加入900 μl LB液體培養(yǎng)基于37 ℃下，220 r/min搖床復(fù)蘇1 h，取100 μl菌液涂布于含抗生素的LB固體培養(yǎng)基，本研究中抗生素僅用氨芐青霉素，與培養(yǎng)基的添加比例為1∶1000。37 ℃恒溫箱倒置培養(yǎng)16 h挑取轉(zhuǎn)化子接種于含4 ml LB培養(yǎng)基的試管中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，獲得氨芐青霉素抗性BL21和氨芐青霉素抗性DH5α新鮮菌液。在100 μl E.coli DH5α和BL21感受態(tài)細胞中，分別加入900 μl LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min搖床活化12 h，獲得無抗BL21和無抗DH5α新鮮菌液。

1.2.3體外菌液培養(yǎng)試驗 菌液分組培養(yǎng)。對照組：試管中加入9.8 ml LB液體培養(yǎng)基，再接種200 μl活化好的新鮮菌液。實驗組：分為牦牛奶添加終濃度為5 mg/ml和0.5 mg/ml兩組。5 mg/ml組中添加7.8 ml LB液體培養(yǎng)基，再添加25 mg/ml濃度的牦牛奶2 ml，接種200 μl活化好的新鮮菌液；0.5 mg/ml組中添加7.8 ml LB液體培養(yǎng)基，再添加2.5 mg/ml濃度的牦牛奶2 ml，接種200 μl活化好的新鮮菌液。其中接種氨芐青霉素抗性BL21和氨芐青霉素抗性DH5α兩組菌液使用的LB培養(yǎng)基添加抗生素。在37 ℃、220 r/min下培養(yǎng)20 h，從0 h起，每隔2小時測定OD600 nm值，第20小時測定pH值。

1.2.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，不同組間比較采用Kruskal-Wallis test檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加牦牛奶促使大腸桿菌BL21和DH5α在LB培養(yǎng)基中增殖

在L B基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的牦牛奶，可為細菌提供營養(yǎng)成分。分別選擇4種不同的大腸桿菌，氨芐青霉素抗性BL21、無抗BL21，氨芐青霉素抗性DH5α、無抗DH5α接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。第18 h的試管外觀照片顯示5 mg/ml組的菌液較其他兩組渾濁（圖1），說明5 mg/ml組的大腸桿菌生長量明顯增多。OD值結(jié)果也表明，添加5 mg/ml的牦牛奶對四種大腸桿菌在一定時間后相比于對照組均有明顯的促進作用（圖2～圖5）。在對照組進入平臺期后，由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，大腸桿菌繁殖速度逐漸減慢，細菌生長率等于死亡數(shù)，不再增長，而5 mg/ml組的大腸桿菌均繼續(xù)增殖，有可能是由于牦牛奶中含有大腸桿菌生長代謝的營養(yǎng)物質(zhì)。

圖1 18 h四種大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中增殖的外觀照片

圖2 氨芐青霉素抗性BL21在LB培養(yǎng)基中的增殖情況

圖3 氨芐青霉素抗性DH5α在LB培養(yǎng)基中的增殖情況

圖4 無抗BL21在LB培養(yǎng)基中的增殖情況

圖5 無抗DH5α在LB培養(yǎng)基中的增殖情況

2.2 添加5 mg/ml牦牛奶使菌液pH值降低

在培養(yǎng)的第20 h，用pH計測量培養(yǎng)液的pH值。結(jié)果表明，添加5 mg/ml牦牛奶使四組大腸桿菌的pH值均有所下降，無抗BL21和無抗DH5α兩組有顯著性差異（圖6）。可能是因為牦牛奶中的糖類物質(zhì)在大腸桿菌的代謝中產(chǎn)生了有機酸，從而引起培養(yǎng)液pH值下降。Stewart等[7]研究發(fā)現(xiàn)，隨著菌液密度的增加，培養(yǎng)基pH值逐漸下降，而降低原因是細菌代謝多糖后產(chǎn)生乳酸和短鏈脂肪酸。

圖6 第20 h四組大腸桿菌的pH值比較

3 討論

大腸桿菌是條件性致病菌，也稱機會致病菌，當機體抵抗力強時，與宿主互利共生，機體免疫力降低時，則引起感染或致病。大腸桿菌因遺傳背景清楚、載體受體系統(tǒng)完備、生長迅速、培養(yǎng)簡單、重組子穩(wěn)定等優(yōu)點廣泛應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域[8-9]。

本研究以牦牛奶為研究對象，探討牦牛奶在體外培養(yǎng)中對不同大腸桿菌生長的影響。在LB培養(yǎng)基中添加牦牛奶培養(yǎng)大腸桿菌試驗中，添加5 mg/ml的牦牛奶對氨芐青霉素抗性的BL21、DH5α和無抗性的BL21、DH5α的生長都有明顯促進作用，試管照片肉眼可見的渾濁也證實了細菌明顯增殖。同時pH值的降低，啟示在腸道菌群中牦牛奶與有機酸的關(guān)系有必要進行深入研究。本研究證實牦牛奶對大腸桿菌BL21和DH5α在體外培養(yǎng)中有促進作用，提示牦牛乳的某些成分具有制成大腸桿菌培養(yǎng)基的潛力，但有待進一步研究。