乾坤散對模型大鼠急性軟組織損傷的改善作用*

袁剛，陳波濤，楊利，殷玥，石牘△

（1.重慶市九龍坡區中醫院，重慶 400080；2.西南大學中醫藥學院，重慶 400700）

急性軟組織損傷屬中醫學“傷筋、軟傷”范疇，是常見的骨傷科損傷，損傷組織的出血、凝血過程，以及細胞失活介導的級聯反應，均可影響損傷組織的修復［1-2］。西醫采用口服或外用非甾體類抗炎藥物如外用雙氯芬酸二乙胺乳膠劑治療，可緩解炎性反應，減輕炎性腫脹和疼痛。中醫外治法在軟組織損傷治療中占有重要地位，中藥外敷是軟組織損傷中醫外治的核心方法。中藥局部外用治療軟組織損傷臨床療效明確，可能與改善局部血液流變學指標水平、消除代謝毒物等機制有關［3-5］。血栓素A2（TXA2）能使血小板聚集形成血栓，前列腺素I2（PGI2）是目前發現的最強的血小板聚集抑制劑［6-7］。中藥內服可改變TXA2和PGI2水平［1，8］。傷科傳統理論認為，“肢體損于外，則氣血傷于內”，但局部外用中藥可否改變體內或損傷組織內TXA2和PGI2水平尚不清楚。乾坤散是重慶中醫骨傷“儒武傷科”代表，也是重慶市九龍坡區非物質文化遺產“魏氏正骨”傳承至今的臨床局部外用驗方。本研究中探討了局部外用乾坤散對急性軟組織損傷模型大鼠血液流變學指標、TXA2及PGI2水平的影響，為中藥“外治內應”機理的研究提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：SZ810 型連續變倍體式顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限責任公司）；SMZ -B4 型微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器有限公司）；WH-2 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團）；EL204 型酶標儀（基因科技<上海>股份有限公司）；ELX800 型雪花機（美國Grant公司）；XB70型掌式離心機（其林貝爾儀器制造有限公司）；LX -100 型移液槍（德國Eppendorf 公司）；MVIS-2045 型全自動血液流變分析儀（重慶天海醫療設備有限公司）；BC-5180 型全自動血細胞分析儀（邁瑞生物醫療電子股份有限公司）。

試藥：乾坤散（重慶市九龍坡區中醫院醫院制劑），由生川烏、當歸、白芷、生南星、梔子、甲珠、生大黃、瓦楞子、生黃柏、三七、乳香、沒藥、橘絡、紅花等組方，按處方比例混合打粉，過120 目篩，凡士林、熱水、藥粉質量比為0.5∶2∶1；雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（北京諾華制藥有限公司，批號為H19990291）；水合氯醛（成都市科隆化學品有限公司，批號為2019121301）；大鼠PGI2酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（批號為YX -160705R），大鼠TXA2ELISA 檢測試劑盒（批號為YX -202401R），均購自上海優選生物科技有限公司。

動物：SD大鼠60只，雌雄各半，體質量180～200 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號為SCXK（湘）2019 -0004，動物合格證號為NO.430727200101466125，于西南大學藥學院實驗動物中心飼養，室內溫度為20～25 ℃，相對濕度為40%～60%，12 h/12 h明暗交替。大鼠的飼養和使用均符合我國《實驗動物管理條例》，本實驗獲得西南大學藥學院實驗動物倫理委員會批準，批號為yxy202102。

1.2 方法

造模、分組與給藥：將SD 大鼠適應性飼養1周，于造模前24 h 用脫毛膏除去右后肢腿毛。按隨機數字表法抽取10 只大鼠為空白組，其余50 只大鼠采用砸傷法復制急性軟組織損傷模型［5，9］。腹腔注射3.5%水合氯醛（1 mL/ 100 g）麻醉，將兩層薄紗片覆蓋于大鼠右大腿中上1/3 內側肌肉豐厚處，采用質量為200 g 的實心球從60 cm 高度塑料圓筒內垂直自由落下，實心球與大鼠肌肉接觸面積為2 cm × 2 cm，連續10 次。參考文獻［9 -10］判斷造模是否成功。50 只大鼠均造模成功，按隨機數字表法分為模型組，雙氯芬酸組（4×10-5g/cm2），乾坤散低、中、高劑量組（0.15，0.30，0.60 g/ cm2），除模型組大鼠外，其余各組大鼠造模2 h后，將對應藥物貼敷于患處，每天2次，連續7 d。

軟組織急性損傷評分：評估造模后24 h、造模后7 d 的腫脹情況，計算軟組織急性損傷評分［9］。1）皮下瘀血。瘀斑計2分；點狀瘀血計1分；無瘀血計0分。2）腫脹程度。皮尺測量大鼠雙側大腿中上1/3 處腿圍，比較腫脹程度。明顯腫脹計2 分；輕微腫脹計1 分；無腫脹計0 分。3）皮膚顏色。瘀暗色深計2 分；瘀暗色淺計1 分；正常計0 分。4）肢體活動。跛行伴活動受限計2 分；傷肢動作遲緩，但活動無明顯受限計1 分；活動正常計0 分。評分時掩蔽分組信息，由3名研究者評分，取平均值。

病理組織學檢查：造模后7 d，麻醉大鼠，處死取損傷部位肌肉組織，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色觀察軟組織損傷病理形態，并進行組織學修復評級［11］。軟組織基本恢復至正常水平，為0級（優）；肌肉組織水腫、瘀血癥狀大部分消失，增生血管和膠原纖維數量基本恢復，為1級（良）；肌纖維腫脹且伴有變性，肌肉組織水腫、瘀血、出血灶稍減輕或部分消失，纖維母細胞浸入，血管增生或膠原纖維增生，為2 級（可）；肌纖維腫脹伴透明變性或明顯壞死伴水腫、出血、嚴重瘀血，為3級（差）。

血液流變學指標及TXA2和PGI2水平測定：分別于造模前、造模后24 h 和造模后7 d 行股動脈采血，采用MVIS-2045 型全自動血液流變分析儀測定全血黏度、全血低切黏度、全血高切黏度，并計算紅細胞聚集指數；采用ELISA 法測定TXA2和PGI2的水平，并計算TXA2/PGI2。

1.3 統計學處理

采用IBM SPSS Statistics 25.0 統計學軟件分析。計數資料以率（%）表示，行Kruskal-Wallis 檢驗。計量資料以表示，行Kolmogorov-Smirnov檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；兩兩比較采用Bonferroni法；組內比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 軟組織急性損傷評分

造模后7 d，與模型組比較，雙氯芬酸組和乾坤散低、中、高劑量組大鼠的軟組織急性損傷評分均顯著降低（P<0.05）；與乾坤散低劑量組比較，乾坤散高劑量組大鼠的軟組織急性損傷評分顯著降低（P<0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠軟組織急性損傷評分比較（，分，n=10）Tab.1 Comparison of scores of acute soft tissue injury of rats in each group（，point，n=10）

表1 各組大鼠軟組織急性損傷評分比較（，分，n=10）Tab.1 Comparison of scores of acute soft tissue injury of rats in each group（，point，n=10）

注：與模型組比較，△P <0.05；與乾坤散低劑量組比較，*P <0.05。Note：Compared with those in the model group，△P <0.05；Com?pared with those in the Qiankun Powder low -dose group，*P <0.05.

2.2 病理組織學檢查結果

造模后7 d，各組大鼠軟組織急性損傷病理形態見圖1。可知，空白組大鼠肌纖維排列整齊，結構完整，形態正常；模型組大鼠肌纖維斷裂嚴重，肌間隙淤血滲出，炎性細胞浸潤；雙氯芬組大鼠肌纖維排列較整齊，結構形態接近正常；乾坤散低、中、高劑量組大鼠局部肌纖維斷裂，肌間隙瘀血滲出、炎性細胞浸潤減少。

造模后7 d，各組大鼠組織學修復評級結果見表2。可知，與空白組比較，模型組大鼠組織學修復評級為優和良的總比例顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，雙氯芬組和乾坤散高劑量組大鼠組織學修復評級為優和良的總比例均顯著升高（P<0.05）。

表2 各組大鼠造模后7 d組織學修復評級結果比較［只（%），n=10］Tab.2 Comparison of histological repair rating of rats in each group after 7 d of modeling［rat（%），n=10］

2.3 血液流變學指標

與空白組比較，造模后24 h 模型組大鼠的血漿黏度、全血低切黏度、全血高切黏度、紅細胞聚集指數均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，造模后7 d，雙氯芬酸組和乾坤散低、中、高劑量組大鼠的全血低切黏度、全血高切黏度、紅細胞聚集指數均顯著降低（P<0.05）。詳見表3。

表3 各組大鼠血液流變學指標比較（，n=10）Tab.3 Comparison of hemorheological indexes of rats in each group（，n=10）

表3 各組大鼠血液流變學指標比較（，n=10）Tab.3 Comparison of hemorheological indexes of rats in each group（，n=10）

2.4 TXA2 和PGI2 水平及TXA2/PGI2

造模后24 h 及造模后7 d，與模型組比較，乾坤散低、中、高劑量組大鼠的TXA2和PGI2水平均無顯著差異（P>0.05）。造模前各組大鼠TXA2/PGI2為0.98～1.01；造模后24 h，模型組和雙氯芬酸組大鼠的TXA2/PGI2均偏離1.0，乾坤散低、中、高劑量組大鼠的TXA2/PGI2均接近1.0；造模后7 d，乾坤散低、中、高劑量組大鼠的TXA2/PGI2均接近1.0。詳見表4。

表4 各組大鼠急性損傷組織中TXA2和PGI2比較（，n=10）Tab.4 Comparison of TXA2 and PGI2 in acute injured tissues of rats in each group（，n=10）

表4 各組大鼠急性損傷組織中TXA2和PGI2比較（，n=10）Tab.4 Comparison of TXA2 and PGI2 in acute injured tissues of rats in each group（，n=10）

3 討論

軟組織損傷導致受損組織中的血管活性物質、前列腺素等炎性介質和酸性產物積聚，誘導損傷部位發生一系列微循環改變，包括毛細血管通透性增加、血流緩慢，嚴重血流淤積甚至閉塞，反復疊加，形成惡性循環［12］。西醫通常采取休息，支具或石膏制動，冷敷，口服非甾體抗炎藥治療［1，13-15］。中醫認為，各種膏、丹、丸散及湯藥熏、蒸、泡、浴均可起到“外治內應”“外用內效”的作用；中藥貼敷治療軟組織損傷臨床應用廣泛，可改善局部血流特性，消除代謝毒物。TXA2和PGI2是血小板聚集和抑制的一對標志物，外用中藥可否改變損傷組織內的TXA2和PGI2水平尚未明確［6-7］。

本研究中，乾坤散外用貼敷可改善模型大鼠的軟組織急性損傷評分和病理形態；且與模型組大鼠比較，造模后7 d，乾坤散高劑量組大鼠的組織學修復評級為優和良的總比例顯著升高（P<0.05），乾坤散低、中、高劑量組大鼠的全血低切黏度、全血高切黏度和紅細胞聚集指數均顯著降低（P<0.05），推測乾坤散貼敷損傷局部可改善損傷組織的微循環，調節血液黏度，從而發揮“外治內應”的作用。雙氯芬酸二乙胺乳膠劑是經典的非甾體類外用鎮痛劑，為前列腺素合成抑制劑，具有抗炎、鎮痛作用。局部應用時，其有效成分可穿透皮膚到達炎性區域，緩解急、慢性炎性反應，減輕炎性腫脹程度，緩解疼痛。本研究中，乾坤散低、中、高劑量組大鼠軟組織急性損傷評分和病理學表現與雙氯芬酸組大鼠均接近，提示乾坤散可能存在抑制炎性組織滲出、炎性細胞浸潤的作用。

TXA2由血小板微粒體合成與釋放，具有較強的血小板聚集能力，可導致血栓形成；PGI2由血管內皮細胞合成，擴張血管作用強烈，可抑制血小板聚集［6-7］。本研究中，空白組大鼠的TXA2/PGI2為1.0，造模后24 h，模型組大鼠的TXA2和PGI2水平均升高，且模型組和雙氯芬組大鼠的TXA2/ PGI2均失衡，乾坤散低、中、高劑量組大鼠的TXA2/PGI2仍維持較好的平衡狀態；造模后7 d，模型組和乾坤散各劑量組大鼠的TXA2和PGI2水平逐漸降至造模前，但雙氯芬酸組大鼠的PGI2水平明顯下降，導致TXA2/ PGI2失衡。推測體內血凝狀態通過TXA2/ PGI2的平衡進行調節。雖然雙氯芬組和乾坤散高、中、低劑量組大鼠的療效評價相近，但作用機制不同，雙氯芬酸二乙胺乳膠劑主要通過抑制PGI2合成而發揮作用，與雙氯芬組相比，乾坤散能更快地調節TXA2/PGI2平衡，可能是實現中藥貼敷“外治內應”、促進微循環改善的重要作用機制。

乾坤散方中，當歸、紅花、乳香、沒藥、三七活血散瘀，瘀去新生；橘絡行氣，使氣行血活；梔子、大黃、黃柏清熱涼血，消腫；甲珠通經絡，消腫；瓦楞子軟堅散結，消腫。諸藥合用，起到散瘀活血、通絡軟堅、消腫止痛的功效。推測局部外用乾坤散治療急性軟組織損傷可能通過改善損傷組織的微循環、機體血液黏度，調節血小板聚集，抑制損傷組織的炎性反應而發揮作用，這可能是傷科“肢體損于外，氣血傷于內”機制和中藥貼敷“外治內應”的理論基礎之一。

綜上所述，局部外用乾坤散可改善急性軟組織損傷模型大鼠的血液流變學指標，調節TXA2/PGI2平衡，改善損傷組織的微循環，實現中藥貼敷治療的“外治內應”效應。