劉靜 梁蓉 高廣勛 董麗華 王健紅 李玉富

彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL）是成人最常見的淋巴系統腫瘤，約占非霍奇金淋巴瘤的30%～40%[1]。由于其高度異質性，分子遺傳學特點和生物學行為有著很大的差別，不同亞型DLBCL治療反應和預后呈現顯著性差異。盡管目前小分子靶向藥物、單克隆抗體、細胞免疫治療等一系列新的治療方法顯著提高了其治療反應率,但仍有部分患者面臨復發難治性的問題[2]，完善預后分層、制定精準的治療方案十分重要。

隨著分子生物學的發展，表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑和非編碼RNA調控在腫瘤發生發展中的作用逐漸受到關注[3]。其中組蛋白甲基轉移酶（ histone methyltransferases，HMTts ）是一類以S-腺苷甲硫（S-adenosyl methionine，SAM）為甲基供體，催化1～3個甲基基團轉移到組蛋白賴氨酸或精氨酸上的甲基轉移酶，G9a是組蛋白H3第9位賴氨酸（H3K9）的甲基轉移酶，能使H3K9發生甲基化，并參與到DNA甲基化、基因轉錄抑制、異染色質形成等過程[4-5]，在腫瘤的發生發展過程中具有重要作用。G9a在多種腫瘤中表達異常增高，如胃癌、膀胱癌、乳腺癌和多發性骨髓瘤等，并與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲等生物學功能有關[6-8]。目前，組蛋白甲基化酶G9a在DLBCL臨床意義的研究未見報道。本研究旨在探討G9a在DLBCL中的表達情況，分析其在DLBCL臨床診療中的價值，為尋找新的預后及治療靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析鄭州大學附屬腫瘤醫院2014年6月至2019年6月經淋巴結活檢后確診的初治DLBCL患者資料，入組的病例需要符合下述條件：1）術后的病理標本及資料保存完整；2）病例基本信息、診治和隨訪資料完整；3）患者病理標本獲取前未行任何抗腫瘤治療且不合并其他惡性腫瘤。本研究共收集75例DLBCL組織標本，同時收集25例初診為淋巴結反應性增生組織標本作為對照組。病理分型按Hans分類法進行；臨床分期參照臨床分期進行；預后評分參照國際預后指數（IPI）評分。

1.2 方法

1.2.1 采用免疫組織化學法檢測G9a在組織中的表達情況 采用免疫組織化學法檢測DLBCL組織及淋巴結反應性增生組織中G9a蛋白的表達，兔抗人G9a單克隆抗體（購自英國Abcam公司）。將石蠟切片在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇水化；用配制好的修復液（EDTA緩沖液，Ph為9.0）修復抗原；然后用3%過氧化氫處理，阻斷內源性過氧化物酶；滴加稀釋好的山羊血清封閉抗原。將切片與兔抗人G9a單抗（稀釋比1∶100）在4℃以下反應過夜，添加山羊抗兔二抗在37℃以下孵育30 min，滴加DAB顯色液于每張切片上染色，Harris蘇木精對比染色，最后進行脫水與封固。在顯微鏡下觀察到細胞質或細胞核中有棕黃色或棕褐色顆粒即為陽性細胞，高倍鏡下觀察染色強度并計數陽性細胞，計算陽性細胞比例。采用半定量[9]積分法判斷結果。按染色強度計分：無色為0分，淡棕色為1分，棕黃為2分，棕褐色為3分；按陽性染色細胞百分率計分：陽性細胞數＜10%為0 分，10%～30%為1分，30%～50%為2分，50%～70%為3分，＞70%為4分。將（染色強度～積分）乘以染色細胞百分率積分的結果分為下述等級：＜2分為陰性（-），≥2分為陽性（+）。

1.2.2 治療及療效評價 患者接受的化療方案包括：CHOP、R-CHOP、R-mini CHOP、EPOCH、R-EPOCH和DHAP方案，部分難治患者或復發患者接受放療及造血干細胞移植治療。療效評價標準：根據2016年美國國立綜合癌癥網絡（NCCN）推薦的淋巴瘤療效標準，每2個周期進行1次療效評估，療效評價包括完全緩解（complete response，CR）：所有疾病的證據消失；部分緩解（partial response，PR）：測量的病變消退并且無新發病灶、疾病進展（progressive disease，PD）：任何新發病灶或病灶較最低水平增長≥50%，疾病穩定（stable disease，SD）：未能達到CR、PR或PD。采用CR、總生存（overall survival，OS）率、無進展期生存（progression-free survival，PFS）率，探討其對患者生存及預后的影響。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。應用χ2檢驗分析G9a蛋白在DLBCL組織與淋巴結反應性增生組織之間表達差異，分析G9a蛋白表達情況與DLBCL臨床特點之間的關系；預后單因素分析采用Kaplan-Meier法，多因素分析采用Cox回歸模型。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 DLBCL組織和淋巴結反應性增生組織中G9a蛋白的表達

G9a蛋白主要在細胞核和細胞質中表達，在DLBCL組織和淋巴結反應性增生組織中有著不同的表達程度。75例DLBCL中49例（65.3%）呈G9a蛋白陽性表達，25例正常淋巴組織中有5例（20.0%）G9a陽性表達，G9a在DLBCL中表達較正常淋巴組織明顯上調，差異具有統計學意義（χ2=14.483，P＜0.001，表1，圖1）。

表1 G9a蛋白在淋巴結反應性增生組織和DLBCL組織中的表達

2.2 G9a蛋白表達與DLBCL患者臨床特征的關系

G9a 蛋白陽性與 G9a 蛋白陰性患者在性別、年齡、B 癥狀、LDH 水平的差異均無統計學意義（均P＞0.05），而 G9a 蛋白表達陽性患者的β2-MG的值，臨床分期，Ki-67 值均較 G9a 蛋白表達陰性患者更高，且差異均具有統計學意義（P值分別為0.041、0.019和0.044，表2）。

表2 G9a蛋白表達與DLBCL患者臨床特征的關系

2.3 G9a蛋白表達與初治療效的關系

G9a蛋白陽性組的49例患者中在初始治療后達CR的患者有29例（59.2%），未達CR有20例（40.8%），G9a蛋白陰性組的26例患者中達CR的患者有18例（69.2%），未達CR有8例（30.8%）。G9a蛋白陽性組與陰性組在初始治療后CR方面，差異無統計學意義（χ2=1.423，P=0.233，P＞0.05，表3），表明G9a蛋白表達與初始治療后的療效無關。

表3 G9a蛋白表達與DLBCL初始治療后療效的關系

2.4 G9a蛋白表達與病理細胞起源的關系

75例患者中，GCB組46例，其中G9a陽性26例，G9a陰性20例，Non-GCB組29例，G9a陽性患者23例，G9a陰性6例，Non-GCB 的G9a表達率高于GCB組（79.3%vs.56.5%），且差異具有統計學意義（P=0.023，P＜0.05）。將不同分子亞型DLBCL納入OS分析，GCB組3年OS率為87.6%，Non-GCB組3年OS為77.5%，差異具有統計學意義（χ2=3.237，P=0.049，P＜0.05，表4，圖2）。提示G9a蛋白在Non-GCB型DLBCL中表達較高，且Non-GCB型與GCB型相比預后更差，生存率更低。

表4 G9a蛋白表達與病理類型的關系

2.5 G9a蛋白表達與DLBCL預后的關系

2.5.1 單因素分析 隨訪截至2020年12月，75例DLBCL患者共獲得完整資料74例， 隨訪率為98.6%。74例DLBCL中至隨訪結束共生存55例，OS為74.3%，無進展生存共47例，PFS率為63.5%。將74例完整病例納入生存分析，將年齡、性別、臨床分期、B癥狀、病理類型、LDH水平、β2-MG、IPI評分、是否CR、G9a表達情況、納入影響患者OS、PFS的單因素分析中，結果顯示（表5，圖3，4）：G9a蛋白陰性組和陽性組的3年OS率分別為89.5%和73.4%，且兩組OS率差異具有統計學意義（χ2=3.815，P＜0.05），G9a蛋白陰性組和陽性組的3年PFS分別為79.3%和59.4%，兩組PFS率差異具有統計學意義（χ2=4.211，P＜0.05），表明G9a表達陽性、Ⅲ/Ⅳ分期、Non-GCB、IPI 3～5分、初始治療未達到CR是DLBCL的不良預后因素。

2.5.2 多因素分析 由表5可見，分期、病理類型、IPI評分、G9a表達陽性是DLBCL患者3年OS的影響因素，將其納入多因素Cox回歸分析，見表6：G9a并非DLBCL患者OS率的獨立預后因素（P=0.381,P＞0.05）。臨床分期、IPI評分、G9a表達陽性、初治是否CR為DLBCL患者3年PFS率的影響因素，將其納入多因素Cox回歸分析，結果見表7：初治CR是影響DLBCL患者3年PFS的獨立預后因素（P=0.010,P＜0.05），而G9a并非DLBCL患者3年PFS率的獨立預后因素（P=0.987,P＞0.05）。

表5 影響DLBCL患者OS和PFS的單因素分析

表6 影響DLBCL患者OS的多因素分析

表7 影響DLBCL患者PFS的多因素分析

3 討論

DLBCL是最常見的非霍奇金淋巴瘤，隨著國內人口老齡化的發展，DLBCL作為一種主要發生于中老年人群的血液系統腫瘤，發病率也越來越高[1，10]。隨著精準治療時代的到來，傳統的化學療法及評分體系受到挑戰，建立包括臨床因素和分子特征的新型預后分層模式和治療策略已經成為研究熱點。在過去的幾年中，基因測序和基因組分析已經發現了DLBCL重要的遺傳損傷，揭示了一些與疾病相關的的基因與途徑的參與，其中一些（如NF-κB、BCR和BCL-6）已被用作臨床實踐中[2]，而一些表觀遺傳學標志物如EZH2、G9a被認為是很有希望的潛在靶點。EZH2可對組蛋白H3第27位賴氨酸進行三甲基化，參與基因表達的調控[11]，已有報道在2l%以上的GCB型DLBCL中發生了EZH2的功能增益突變，EZH2的抑制可使生發中心B細胞停止生長分化，也可導致相關抑癌基因（如PRC2調控的基因）的表達上調。因此，EZH2抑制劑或可成為治療生發中心來源的DLBCL的新靶點[12-13]。

G9a是組蛋白H3第9位賴氨酸（H3K9）的甲基轉移酶，能使H3K9發生甲基化，并參與到DNA甲基化、基因轉錄抑制、異染色質的形成等過程[3-4]，而這些在腫瘤的發生發展過程中都有著重要作用，針對組蛋白甲基轉移酶G9a的抑制劑也正在開發中。G9a在許多癌癥如乳腺癌，膀胱癌中過表達，G9a的高表達可以激活下游上皮細胞黏附分子（Ep-CAM）從而引起腫瘤細胞的侵襲和轉移[14]。據報道G9a在ALL中也存在過表達，該研究發現G9a抑制劑以劑量依賴的方式降低人T淋巴母細胞（Jurkat細胞）的生存能力，并伴有P53，TP73，BAX和MDM4表達的增加，抑制G9a可誘導ALL中促凋亡基因的表達并促進細胞死亡[15]。G9a在肝癌患者中的表達明顯高于正常人肝組織，敲除細胞中G9a基因后，瘤細胞生長周期停滯且細胞形態發生明顯變化，侵襲性減弱[16]；G9a在乳腺癌組織中表達增加，其調控腫瘤轉移的途徑之一是調控MSK1的激活和表達[17]。另外腫瘤細胞代謝有一個必需通路：絲氨酸-甘氨酸生物合成通路，而G9a是維持這條通路處于活性狀態的酶基因, 也是在此通路應答絲氨酸缺乏時轉錄激活所必需的，這也暗示G9a可能參與原癌基因或抑癌基因在胚胎發育中的調控表達，其通過增加絲氨酸的產出來增強細胞的生長和轉化潛能；若G9a失活, 絲氨酸及它的下游代謝產物就相應減少, 引發腫瘤細胞自噬死亡[18]。更重要的是，G9a在細胞分裂過程中與DNA甲基轉移酶1進行物理相互作用，以協調DNA和組蛋白的甲基化，從而促進靶基因的轉錄沉默[19]。從這個意義上講，抑制G9a的功能，不僅降低組蛋白甲基化水平，也會在一定程度上降低DNA甲基化水平從而導致抑癌基因的重新激活并抑制癌細胞的增殖。上述研究均提示，抑制G9a表達可降低癌細胞增殖，阻斷腫瘤轉移并延緩疾病進展。

最新的體外細胞實驗[20]結果示：G9a 抑制劑 BIX-01294 對人 DLBCL 細胞系的增殖有明顯抑制作用，而對正常人外周血單核細胞系抑制效果不明顯， 表明G9a 抑制劑對 DLBCL 有相對特異的抑制作用。該研究還揭示了其抑制 DLBCL 增殖的途徑：1）G9a抑制劑可以增加P21表達水平和降低細胞周期蛋白E水平導致細胞周期G1期停滯，引起DLBCL細胞發育障礙；2）其通過內源性和外源性凋亡途徑誘導DLBCL細胞凋亡；3）其還通過激活內質網應激觸發人類DLBCL細胞中的自噬凋亡。這些研究均提示G9a蛋白在DLBCL細胞增殖和凋亡調控中發揮著重要作用。本研究發現G9a蛋白表達陽性DLBCL患者的β2-MG，臨床分期，Ki-67水平均較G9a蛋白表達陰性患者更高，提示G9a可能與DLBCL的增殖和進展有關，此外G9a蛋白還是影響初治DLBCL患者3年OS和3年PFS的不良預后因素。

本研究首次發現與淋巴結炎性增生組織相比，組蛋白甲基化酶G9a 蛋白在DLBCL中表達明顯增加；并進一步揭示了G9a的表達與DLBCL的臨床特征、療效及預后有一定的關系，但仍需要擴大樣本進一步驗證。后續應開展G9a在DLBCL作用機制的深入研究，進一步探討G9a在DLBCL發生發展中的意義。