程會賢 陳名園 陳婷婷 張燕 王梅 劉天民 況薇 王巍

卵巢高級別漿液性癌（high-grade serous ovarian carcinoma，HGSC）是卵巢癌中發病率最高的組織學類型[1]。腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）包括CD4陽性（CD4+）T細胞、CD8陽性（CD8+）T細胞、NK細胞等多個細胞亞群，對于腫瘤的發展、預后及治療至關重要。本課題組前期的研究顯示，CD8+TIL與多種腫瘤預后密切相關，在HGSC研究中亦得到相似的結果[2]。Webb等[3]研究發現，僅位于卵巢癌腫瘤上皮內的CD8+TIL與患者預后相關，這可能與上皮內CD8+TIL具有免疫記憶性有關。

記憶T細胞是腫瘤免疫記憶的主要細胞群體，包括中央記憶、效應記憶和組織駐留記憶T細胞（tissue resident memory T cells, TRM）。TRM較中央、效應記憶T細胞的免疫反應更迅速強烈，且具有組織駐留特性，可長期在腫瘤組織局部持續發揮效應[4]。TRM包括CD8+T細胞、CD4+T細胞，CD103為TRM細胞表面特異性標志物，與其配體E-鈣黏蛋白（E-cadherin）結合在TRM介導其組織駐留中起到重要作用[4-5]。研究顯示，CD103陽性（CD103+）TIL可改善食管癌[6]等實體腫瘤的預后，但對于CD103+TIL在卵巢癌中的表達尚未明確。因此，本研究旨在通過CD103+TIL在經初次腫瘤減滅術（primary debulking surgery，PDS）或新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NACT）的HGSC患者中的表達情況探討其與治療、預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 回顧性分析2018年6月至2019年6月四川大學華西第二醫院收治的191例術后病理診斷為HGSC患者的臨床病理資料，排除非原發卵巢癌、多發腫瘤、未行完全分期手術、術后未行化療、失訪患者54例，最終納入137例，分為PDS組83例和NACT組54例。

1.1.2 主要試劑 免疫組織化學法一抗試劑包括：兔CD103單抗（稀釋比例1∶3 000）、鼠CD8單抗（稀釋比例1∶200）、兔CD4單抗（稀釋比例1∶1 000）、Ecadherin（即用型抗體），CD103、CD8、CD4一抗試劑均夠自英國Abcam公司；二抗試劑與DAB酶底物顯色試劑、E-cadherin抗體均購自福州邁新生物技術有限公司。免疫熒光共染法中，封閉液為5%山羊血清購自愛必信上海生物科技有限公司；一抗試劑為兔CD103單抗（稀釋比例1∶50）、鼠CD8單抗（稀釋比例1∶100），二抗試劑為羊抗兔488單抗（稀釋比例1∶500）、羊抗鼠647單抗（稀釋比例1∶200），均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法 對每例患者的石蠟包埋組織選取1個位點，制成組織芯片（tissue microarray，TMA），單個芯片直徑為2 mm，共制成6個蠟塊。每個蠟塊有30個位點（5行×6列），行5 μm厚連續切片5張。隨機選取4個高倍鏡下（×400）視野行CD103+TIL、CD8 +TIL、CD4+TIL計數，并求其平均值，細胞數高于平均值則為高浸潤（記為high），低于平均值（記為low），并行進一步CD103highCD8highTIL、CD103lowCD8highTIL、CD103lowCD8lowTIL分組。TIL分布定位：1）腫瘤上皮內浸潤：定義為癌細胞巢內或與癌細胞直接接觸的TIL；2）間質浸潤：定義為間質區域內未與癌細胞直接接觸的TIL[3]。

1.2.2 免疫熒光共染法 采用免疫熒光共染間接法對組織芯片進行染色，使用LSM 980激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）進行觀察，綠色熒光為CD103+TIL，紅色熒光為CD8+TIL。

1.2.3 隨訪 通過電話和門診進行隨訪，隨訪時間為24～36個月。術后病理確診至患者復發、死亡或最后1次隨訪時間為無進展生存時間（progression-free survival，PFS）。截至2021年6月。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。組間比較采用χ2檢驗或Mann-Whitney檢驗，相關性采用Spearman檢驗；采用Kaplan-Meier檢驗行單因素生存分析，采用Cox比例風險回歸模型行多因素生存分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理特征

PDS組和NACT組患者的術后復發、死亡分別為36例和14例。兩組患者其他臨床病理特征見表1。

表1 患者的臨床病理特征

2.2 兩組患者CD103+TIL、CD8+TIL、CD4+TIL與臨床病理特征的關系

PDS組患者腫瘤上皮內CD103+TIL、CD8+TIL、CD4+TIL與臨床病理特征均無顯著性相關（P＞0.05）。NACT組患者腫瘤上皮內CD103+TIL、CD8+TIL高浸潤患者的化療敏感性較高（P=0.03、P=0.018），而CD4+TIL與臨床特征均無顯著性相關（P＞0.05）。

Spearman相關性檢驗發現，CD103+TIL表達與CD8+TIL具有顯著性相關（r=0.878，P＜0.01），但與CD4+TIL無顯著性相關（r=0.211，P=0.013）。CD103+TIL與腫瘤細胞表面E-cadherin表達無顯著性相關（r=0.065，P=0.451）。

2.3 免疫組織化學法檢測兩組患者的陽性細胞計數

免疫組織化學法檢測顯示，NACT組CD103+TIL（P=0.026）及CD8+TIL （P=0.029）數量高于PDS組，PDS組和NACT組中的E-cadherin陽性表達率為96.39%（80/83）和94.44%(51/54）。見表2和圖1，2。

表2 免疫組織化學法檢測兩組患者的陽性細胞計數

2.4 免疫熒光共染法檢測兩組患者腫瘤上皮內CD103+TIL和CD8+TIL染色

免疫熒光共染法檢測顯示，除個別細胞外，CD103+TIL細胞膜多出現CD103和CD8分子雙陽性表達（細胞膜呈黃色熒光），CD8陰性TIL表面則無CD103表達。同時可見部分CD8+TIL無CD103表達，即并非所有CD8+TIL均可表達CD103（圖3）。

2.5 單因素生存分析

PDS組的中位PFS為26.0（2.0～36.0）個月，NACT組的為20.0（7.0～36.0）個月。PDS組和NACT組患者的腫瘤上皮內CD103+TIL、CD8+TIL高浸潤表達均具有預后意義（P=0.018、P= 0.004和P=0.012、P=0.005，圖4）。根據腫瘤上皮內CD103+TIL、CD8+TIL表達情況，進一步分為CD103highCD8highTIL、CD103lowCD8highTIL、CD103lowCD8lowTIL組，PDS組和NACT組的腫瘤上皮內CD103highCD8highTIL組預后均最佳（P=0.013和P=0.036，圖5）。

2.6 Cox比例風險回歸模型多因素生存分析

CD103+TIL高浸潤（HR=0.085，95%CI：0.011～0.645，P=0.017），腫瘤上皮內CD103highCD8highTIL（HR=0.020，95%CI：0.002～0.201，P=0.001），化療敏感性（HR=19.903，95%CI：9.492～41.733，P＜0.01），FIGO分期（HR=12.023，95%CI：1.143～126.442，P=0.038）是HGSC患者獨立預后因素。

3 討論

TIL是腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中一群具有異質性的淋巴細胞，其組成包括CD4+T細胞、CD8+T細胞等多種不同的細胞亞群，在腫瘤治療、預后與轉歸中扮演不同的角色，其中CD8+TIL是主要的抗腫瘤細胞[2]。但有研究發現，HGSC預后與腫瘤間質中CD8+TIL無關，僅與腫瘤上皮內CD8+TIL表達水平相關，推測腫瘤上皮內CD8+TIL是具有外周組織駐留特性的記憶性T細胞亞群（即TRM）[3]。TRM是機體屏障部位的“第一道防線”，通過釋放多種促炎因子和趨化因子以及直接釋放穿孔素和顆粒酶等細胞毒性分子來發揮免疫效應[4]。CD103為TRM的表面標志物，研究顯示CDl03+TIL可改善多種腫瘤患者的預后，而且在不同腫瘤中CDl03+TIL可表達于CD4+T或CD8+T細胞亞群[6-7]。對于HGSC中的CD103表達于何種T細胞、在腫瘤中如何分布以及CD103+TIL表達水平對患者的預后影響需深入了解。

正常情況下，人體內TRM主要包括CD8+T細胞及CD4+T細胞，CD8+T細胞主要位于組織上皮層，CD4+T細胞則多在固有層及間質中存在[4]。目前，CD8+TRM細胞的發生與維持機制尚未明確，推測是由循環中CD8+T細胞進入腫瘤組織，在TME影響下表達CD103的不同水平，與腫瘤細胞表面E-cadherin相結合，將CD8+TIL錨定于腫瘤局部成為CD8+TRM，持續發揮抗腫瘤作用[8]。

本研究發現，CD8+TIL在腫瘤上皮內表達水平高于間質，而CD4+TIL則主要分布于腫瘤間質，且總數也明顯少于CD8+TIL；CD103+TIL大量分布于腫瘤上皮內，間質中偶見表達，通過免疫熒光共染法證實CD103+TIL主要為CD8+TIL。本研究PDS組和NACT組中的腫瘤上皮內CD8+TIL高浸潤患者預后均明顯優于低浸潤者，而間質中CD8+TIL表達與預后無顯著性相關。此外，兩組患者的CD4+TIL無論在腫瘤上皮內還是間質中均差異無統計學意義，與預后無關，這可能是由于CD4+T細胞具有雙向調節功能，既可以輔助細胞免疫，也可以發揮負性免疫調節作用[9]。本研究的多因素生存分析顯示，CD103+TIL高浸潤為HGSC獨立預后因素，基于CD103+TIL細胞膜多出現CD103和CD8分子雙陽性表達，且大多定位于腫瘤上皮內，而間質中CD103+TIL表達分布較少的情況，提示HGSC患者的TME可誘導CD8+TIL表達CDl03，使CD8+TIL變為CD8+TRM長期駐留于腫瘤上皮內，持續發揮抗腫瘤免疫效應。

本研究發現，NACT組患者的腫瘤上皮內CD103+TIL和CD8+TIL表達顯著高于PDS組，且高浸潤患者具有較高的化療敏感性，提示NACT可能會通過調節CD103在CD8+TIL上的表達，一方面使長期駐留于腫瘤局部中的CD8+TIL增多，另一方面還可直接增強CD8+TIL抗腫瘤能力。Chang等[10]研究就表明，鉑類藥物可協同增強腫瘤特異性CD8+TIL細胞作用，并增加顆粒酶或穿孔素的分泌。Miyashita等[11]也證實，乳腺癌患者接受NACT后，CD8+TIL可在癌巢聚集，而免疫抑制性FOXP3+T細胞可低表達甚至缺失。上述研究提示，NACT可調節免疫平衡，激活免疫應答而減弱免疫抑制效應，增加CD8+TIL的抗腫瘤免疫功能。有研究顯示，CD103的配體E-cadherin可通過控制細胞黏附和運動在腫瘤抑制中發揮重要作用[12]，但本研究未發現NACT組的E-cadherin表達水平有明顯升高，與Wang等[13]研究結果較為一致。而另一項研究表明，CD103與Ecadherin相互作用在CD8+TIL抗腫瘤應答中起重要作用[14]。上述研究結果至少說明下述問題：1）NACT能明顯促使CD8+TIL表達CD103；2）腫瘤細胞所表達的E-cadherin能通過與CD8+TIL表面CD103相結合，使CD8+TIL長期駐留在腫瘤局部形成CD8+TRM；3）E-cadherin在腫瘤免疫中的生物學效應可能取決于CD8+TIL錨定腫瘤局部的能力，而非直接參與免疫應答。

綜上所述，本研究發現CD103+TIL在HGSC具有重要抗腫瘤作用，CD103+TIL較CD8+ TIL是更佳的預后評估分子；因CD103+TIL能更直接反映與腫瘤細胞密切接觸的TIL，CD103與腫瘤細胞膜上Ecadherin相結合后介導CD8+ TIL定位并長期駐留于腫瘤局部成為CD8+TRM，從而持續地發揮免疫殺傷作用，CD103是CD8+TIL具有更高免疫活性的體現。本研究的不足之處是CD8+TRM細胞在腫瘤局部的維持、調控以及在抗腫瘤免疫中的具體生物學過程尚不清楚，還需進行深入研究。上調CD8+TIL表面CD103表達，增加腫瘤相關CD8+TRM細胞的數量，提高免疫治療水平，可能也是抗腫瘤研究的一個新嘗試。