橄欖油中磷脂含量測定方法學研究

◎ 楊玉瓊，李 遙，魏劭恒，李佳俐，唐順之，許文東

（廣州白云山漢方現代藥業有限公司 中藥制藥過程技術與新藥創制國家工程研究中心 廣東省藥用脂質重點實驗室，廣東 廣州 510240）

初榨橄欖油是木本科油料作物油橄欖樹的成熟果實經過冷榨提取得到的油品，富含多酚、生育酚、角鯊烯和甾醇等多種微量營養成分，油酸含量高達55%～83%，食用橄欖油可預防心血管疾病、改善炎癥和腸道菌群[1-3]。油橄欖樹原生長于希臘、西班牙、意大利等地中海沿岸國家，在1964年經周恩來總理從阿爾巴尼亞引種至國內[4]。經過多年的試種和栽培，至今在我國甘肅隴南、四川廣元、云南昆明、陜西城固和湖北宜昌等地區形成多個油橄欖適生區[5]。初榨橄欖油的生產是以新鮮采摘的油橄欖果為原料，采用先進的成套連續生產設備分離得到鮮榨橄欖油，最終經靜置沉淀去除多余水分和雜質后得到可供食用的初榨橄欖油。國外有研究報道，在剛生產出來而未經沉淀的呈渾濁狀態的初榨橄欖油中，蛋白質含量只有0.05～2.40 mg·kg-1，磷含量只有0.8～4.8 mg·kg-1（相當于磷脂含量為21～124 mg·kg-1），而在經過濾之后以及市售的初榨橄欖油和精煉橄欖油中，蛋白質和磷脂含量都明顯降低[6]。這是由于初榨橄欖油生產工藝的獨特性，油橄欖果中的蛋白質、磷脂等膠質成分在分離和沉淀過程中被除去，類似于油脂精煉過程的水化脫膠工序，最終使得在成品初榨橄欖油中殘留極少的膠質成分[7]。由于橄欖油中磷脂含量較低，本研究通過對推薦性國家標準《糧油檢驗 磷脂含量的測定》（GB/T 5537—2008）[8]中的鉬藍比色法進行方法學驗證，測定了國產橄欖油中真實的磷脂含量，為深入研究國產橄欖油的微量成分以及國產橄欖油的綜合利用開發提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧化鋅（化工級，天津市福晨化學試劑廠）；鹽酸（分析純，廣州化學試劑廠）；氫氧化鉀、鉬酸鈉和硫酸聯氨（均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；硫酸（分析純，珠海市華成達化工有限公司）；磷酸二氫鉀對照品（含量100.0%，中國食品藥品檢定研究院）；初榨橄欖油（特級，產自四川廣元）；精煉橄欖油（自制）。

1.2 儀器與設備

電子天平（BSA224S-CW型，德國賽多利斯集團）、紫外-可見分光光度計（TU-1901型，北京普析通用儀器有限責任公司）、馬弗爐（SGM28型，洛陽市西格馬儀器制造有限公司）、電爐（ST3006型，廣東尚朋堂電器有限公司）、水浴鍋（HH-6型，常州金壇精達儀器制造有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 方法依據

依據《糧油檢驗 磷脂含量的測定》（GB/T 5537— 2008）中的鉬藍比色法進行橄欖油中磷脂含量方法驗證和測定。

1.3.2 溶液配制

鹽酸溶液：取鹽酸50 mL，溶解于50 mL水中即得。5%鉬酸鈉稀硫酸溶液：量取140 mL濃硫酸，注入300 mL水中，冷卻至室溫，加入12.5 g鉬酸鈉，溶解后用水定容至500 mL，充分搖勻，靜置24 h備用。0.015%硫酸聯氨溶液：取硫酸聯氨0.15 g，溶解于 1 L水中即得。氫氧化鉀溶液：取50 g氫氧化鉀溶解在50 mL水中即得。對照品溶液：精密稱取磷酸二氫鉀0.439 3 g，至100 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻；再精密量取1mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即得每1 mL含磷10 μg的標準磷溶液。供試品溶液：取供試品10 g，加氧化鋅0.5 g，先在電爐上緩慢加熱至樣品變稠，逐漸加熱至全部炭化，將坩堝送至550～600 ℃的馬弗爐中灼燒至完全灰化（白色），時間約為2 h。放冷，加鹽酸溶液10 mL，煮沸 5 min至殘渣溶解，將溶解液過濾注入100 mL量瓶中，每次用大約5 mL熱水沖洗坩堝和濾紙3～4次，待濾液冷卻至室溫后，用氫氧化鉀溶液中和至出現渾濁，緩慢滴加鹽酸溶液使氧化鋅沉淀全部溶解，再加2滴，最后用水稀釋至刻度，搖勻。同時制備一份 樣品空白。

1.3.3 測定

精密量取標準磷溶液0 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL和8 mL，分別置50 mL比色管中，各補加水至10 mL，分別加0.015%硫酸聯氨溶液8 mL，加2.5%鉬酸鈉稀硫酸溶液2 mL，加塞，振搖3～4次，去塞，將比色管放入沸水浴中加熱10 min，取出放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置10 min。用試劑空白調整零點，在650 nm處分別測定吸光度，以吸光度為縱坐標，含磷量為橫坐標（10 μg、20 μg、40 μg、60 μg和80 μg）繪制標準曲線，計算回歸方程。

另精密量取供試品溶液10 mL，照標準曲線制備項下自“分別加入0.015%硫酸聯氨溶液8 mL”起同法操作，用樣品空白調整零點，測定其吸光度，由回歸方程計算含磷量，即得。

1.3.4 計算

供試品中的磷脂含量以磷含量表示（供試品磷脂含量為供試品磷含量乘以系數26.31），按下式計算：

式中：X表示供試品中磷含量，mg·kg-1；P表示從標準曲線查得的供試品溶液的含磷量，μg；m表示供試品重量，g；V1表示供試品灰化后稀釋的體積，100 mL；V2表示測定時量取供試品溶液體積，10 mL。

2 結果與分析

2.1 專屬性

分別取樣品空白溶液、供試品溶液和對照品溶液在400～800 nm進行波長掃描，記錄光譜圖（圖1）。結果顯示，供試品溶液與對照品溶液光譜吸收基本一致，空白溶液無干擾，說明本方法測定橄欖油中磷脂含量的專屬性良好。

圖1 專屬性光譜圖

2.2 線性和范圍

取對照品溶液依法操作，在650 nm處分別測定吸光度，以吸光度為縱坐標，含磷量為橫坐標繪制標準工作曲線，計算回歸方程。不同含磷量對應的吸光度如表1所示，結果顯示本方法在10～80 μg線性關系良好，能滿足橄欖油磷脂含量測定的要求。

表1 線性和范圍表

2.3 檢測限和定量限

制備11份樣品空白溶液，依法操作，用試劑空白調整零點，測定吸光度，按照基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法計算儀器檢測限（Limit of Detection， LOD）和定量限（Limit of Quantitation，LOQ）。 LOD=3.3δ/S，LOQ=10δ/S，δ為空白響應值的偏差，S為標準曲線的斜率。儀器檢測限和定量限如表2所示。本方法檢測限和定量限分別為0.42 mg·kg-1和1.28 mg·kg-1。

2.4 精密度

2.4.1 重復性

取供試品10 g共6份，分別加入1 mg·mL-1的標準磷溶液0.1 mL，制成加標供試品，按照“1.3.2 溶液配制”制備成供試品溶液，并按照“1.3.3 測定”依法操作，測定吸光度，計算磷含量。如表3所示，加標供試品重復性RSD小于6%，說明本方法重復性良好。

表2 檢測限和定量限表

表3 加標供試品重復性試驗結果表

2.4.2 中間精密度

另制備6份加標供試品，在不同時間由不同人員依法操作，測定吸光度，計算磷含量，與重復性數據進行整合分析。如表4所示，中間精密度RSD小于6%，說明本方法中間精密度良好。

表4 中間精密度試驗結果表

2.5 準確度

按照80%、100%、120%加標，制備9份加標供試品溶液，依法操作，測定吸光度，計算磷含量。準確度回收率試驗結果如表5所示，平均回收率在80%～115%，RSD小于6%，說明本方法準確度良好。

2.6 耐用性

2.6.1 溶液穩定性

取加標供試品溶液5份，分別于室溫放置0 h、1 h、 2 h、4 h和8 h后依法操作，測定吸光度。溶液穩定性試驗結果如表6所示，溶液在8 h內測定的吸光度RSD小于6%，說明供試品溶液在8 h內測定結果穩定性較好。

表5 回收率試驗結果表

表6 溶液穩定性試驗結果表

2.6.2 硫酸聯氨溶液用量考察

取加標供試品溶液5份，分別加入0.015%硫酸聯氨溶液7.0 mL、7.5 mL、8.0 mL、8.5 mL和9.0 mL，后續依法操作，測定其吸光度。硫酸聯氨溶液用量考察結果如表7所示，吸光度RSD小于6%，說明硫酸聯氨溶液用量在7.0～9.0 mL對吸光度測定影響較小。

表7 硫酸聯氨溶液用量考察結果表

2.6.3 鉬酸鈉溶液用量考察

取加標供試品溶液5份，分別加入0.015%硫酸聯氨溶液8 mL，再分別加2.5%鉬酸鈉稀硫酸溶液 1.6 mL、1.8 mL、2.0 mL、2.2 mL和2.4 mL，后續依法操作，測定其吸光度。鉬酸鈉溶液用量考察結果如表8所示，吸光度RSD小于6%，說明鉬酸鈉溶液用量在1.6～2.4 mL對吸光度測定影響較小。

2.7 橄欖油中磷脂含量測定

取3批初榨橄欖油和3批精制橄欖油樣品按驗證后的磷脂含量測定方法進行檢測，結果如表9所示。國產初榨橄欖油的磷含量為4.57～5.27 mg·kg-1（磷脂含量為120～139 mg·kg-1），高于國外文獻報道（經沉淀后初榨橄欖油磷含量1.0～1.4 mg·kg-1）[6]，經過精煉后橄欖油的磷含量則進一步降低。

表8 鉬酸鈉溶液用量考察結果表

表9 橄欖油樣品中磷脂含量測定結果表

3 結論

通過對《糧油檢驗 磷脂含量的測定》（GB/T 5537— 2008）中的鉬藍比色法的方法學研究表明，檢測限和定量限、線性和范圍、精密度、準確度以及耐用性均符合方法學要求，能滿足橄欖油中低磷脂含量的測定。同時測定結果表明國產初榨橄欖油的磷脂含量較低，雖然高于國外初榨橄欖油磷脂含量水平，但要低于傳統脫膠精煉油的要求（磷含量在5～10 mg·kg-1）[9]。