大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物的 制備及功能特性

◎ 路 暢，劉佳哲，吳小芝，張東娜，王喜萍

(吉林農業科技學院，吉林 吉林 132001）

目前，國內外關于大豆分離蛋白-多糖美拉德反應的研究大多以美拉德反應機理的研究為主，其原材料多糖使用葡萄糖、乳糖、麥芽糖較多，本試驗原材料殼聚糖的選擇相對比較新穎。對于反應產物的研究現有的多是抑制褐變、保鮮以及和氨基酸（酪氨酸）的相互作用等方面，有關其功能特性的研究少之又少，此次試驗將為以后的研究提供依據。

已知大豆分離蛋白是以大豆粕為原料生產的食品添加劑，營養全面，是可替代動物蛋白的植物蛋白，含約90%蛋白質，氨基酸種類齊全[1-3]。單獨的大豆分離蛋白無法擁有多個特性，難以進一步應用，因此對大豆分離蛋白進行改性，具有重要意義[2-3]。甲殼素N-脫乙酰基生成堿性多糖殼聚糖，與甲殼素、纖維素化學結構相近，具有細胞親和性、生物降解性和生物效應等性質，殼聚糖2C位上是氨基，與甲殼素、纖維素不同，活性更強，因此具有更優異的生物學功能，可用于化學修飾[4]。本試驗以二者為原料進行美拉德反應（天然化學改性），進一步提升蛋白質的功能特性(如乳化活性、乳化穩定性、起泡性和溶解性等)[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(山東愛采生物科技有限公司）；殼聚糖(蘇州美億辰生物科技有限公司)。

DPPH粉末、HCl、NaOH、NaCl、甲醇、pH 7.0的磷酸緩沖液及十二烷基硫酸鈉（均為天津市鼎盛鑫化工有限公司）；花生油（市售）；試驗用水均為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

AL-2045電子天平，上海菁海儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；SY-720超聲波清洗機，昆山超聲儀器公司；BCD-221WDPT冰柜，青島海爾股份有限公司；DHL-820A恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；H2050R高速冷凍離心機，湖南湘儀試驗室儀器開發有限公司；SK-1快速混勻器，金壇市城東新瑞儀器廠；V-721PC紫外分光光度計，上海馳唐儀器設備有限公司。

1.3 大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應條件優化

1.3.1 工藝流程

大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物制備的工藝流程為：大豆分離蛋白+殼聚糖→混合→攪拌→調pH→反應釜反應→冷卻→透析→不同分子量美拉德反應產物。

1.3.2 0.1 mol·L-1DPPH溶液的配制

用分析天平稱取DPPH粉末0.004 g，用甲醇溶解，100 mL容量瓶定容，制得0.1 mol·L-1的DPPH溶液。

1.3.3 測定美拉德反應產物DPPH清除率

取3只比色管，分別加入以下物質。①加入樣液2 mL、0.1 mol·L-1DPPH溶液6 mL。②加入樣液2 mL、甲醇溶液6 mL。③加入甲醇溶液2 mL、0.1 mol·L-1DPPH溶 液6 mL。然 后 分 別 以3 500 r·min-1離 心 20 min，測定其在517 nm波長的吸光度。美拉德反應產物DPPH清除率的計算公式為：

美拉德反應產物DPPH清除率=

式中：A1為管①的吸光值；A2為②管的吸光值；A3為③管的吸光值。

1.4 單因素試驗

在試驗中，有許多的因素影響大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物的生成。主要有大豆分離蛋白∶殼聚糖（質量比）、反應溫度、反應時間以及反應pH。

1.4.1 大豆分離蛋白∶殼聚糖（質量比）對大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應的影響

將大豆分離蛋白與殼聚糖按1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0和1.0∶2.5（質量比）比例配制反應物，進行大豆分離蛋白與殼聚糖的美拉德反應，反應溫度60 ℃，反應時間80 min，反應pH值為4，以反應產物的DPPH清除率為考察指標，確定大豆分離蛋白∶殼聚糖的較佳值。

1.4.2 反應溫度對大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應的影響

按優化的大豆分離蛋白-殼聚糖配制反應物(從試驗中得到的質量比），分別選取反應溫度40 ℃、 50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃，進行大豆分離蛋白與殼聚糖的美拉德反應，反應80 min，反應pH值為4，以反應產物的DPPH清除率為考察指標，確定大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應的較佳反應溫度。

1.4.3 反應時間對大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應的影響

按優化的大豆分離蛋白-殼聚糖配制反應物（從試驗中得到的質量比、反應溫度），分別選取提取時間40 min、60 min、80 min、100 min和120 min，反應pH值為4，進行大豆分離蛋白與殼聚糖的美拉德反應，以反應產物的DPPH清除率為考察指標，確定大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應的較佳反應時間。

1.4.4 反應pH對大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應的影響

按優化的大豆分離蛋白-殼聚糖配置反應物（從試驗中得到的質量比、反應溫度、反應時間），分別選取提取pH值為2.0、3.0、4.0、5.0和6.0，進行大豆分離蛋白與殼聚糖的美拉德反應，以反應產物的DPPH清除率為考察指標，確定大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應的較佳反應pH。

1.5 正交試驗設計

根據單因素試驗的結果，以大豆分離蛋白-殼聚糖質量比、反應的溫度、時間以及pH為影響因素，DPPH清除率為評價指標，完成正交試驗，確定最優反應組合。因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.6 大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物的純化（樣品純化）

以正交試驗得出的最優反應條件組合進行大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物的制備。采用3 500 Da 和8 000 Da的透析袋進行透析，得到分子量＜3 500 Da、 分子量為3 500～8 000 Da、分子量＞8 000 Da的樣液，烘干后得到樣品，用于功能特性的測定。

1.7 大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物功能特性的測定

1.7.1 乳化活性的測定

稱樣品0.1 g溶解于20 mL、pH值為7.0的PBS緩沖液（0.05 mol·L-1），充分攪拌，水化30 min，加入 4.0 mL花生油，均質（8 000 r·min-1、1 min）。迅速從乳液下端量取100 L乳濁液，離散到10 mL 0.1%的月桂醇硫酸鈉溶液中，于500 nm波長下測定該稀釋液的吸光度A0，吸光度A0與界面面積呈正相關[6-7]。乳化活性的計算公式如下：

式中：A為大豆分離蛋白，m2·g-1；n為稀釋倍數；?為體系中油相所占的比例，本試驗為0.2；c為蛋白質溶液的濃度，g·mL-1；l為比色池光徑，本試驗為1 cm。

1.7.2 乳化穩定性的測定

上述樣品靜置15 min，從下端量取100 μL乳濁液，離散于10 mL 0.1%的月桂醇硫酸鈉溶液中，測定 500 nm波長的吸光度At[6-7]。乳化穩定性以es表示，計算公式如下：

式中：A0為0時刻吸光值；An為n時刻時吸光值；ΔA為Δt內吸光值差。

1.7.3 起泡性的測定

起泡性的測定采用攪打發泡測定法，即用pH值為7.0的PBS緩沖溶液溶解樣品，配成3%的乳濁液。取200 mL 3%乳濁液，打泡（8 000 r·min-1、3 min），測泡沫體積，記錄為V0[8-9]。按下式計算起泡度（FAI）：

靜置30 min，測泡沫體積，記錄為VT[7-8]。按下式計算泡沫穩定性（FS）：

1.7.4 溶解性的測定

稱取樣品100 mg，15 mL蒸餾水溶解，用低濃度NaOH或HCl溶液調節pH，攪拌30 min，離心 （4 000 r·min-1、30 min）。凱氏定氮法測定該pH條件下可溶性蛋白質含量及總氮含量[8-9]。溶解度計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 大豆分離蛋白-殼聚糖質量比對大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物的影響

由圖1可知，隨著大豆分離蛋白-殼聚糖質量比的減小，DPPH清除率呈現出先增大后減小的趨勢，大豆分離蛋白-殼聚糖質量比為1.0∶1.0的DPPH清除率最大，即大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物的物料比為1.0∶1.0時產量最優。

圖1 大豆分離蛋白∶殼聚糖（質量比）對反應產物的影響圖

2.1.2 反應溫度對大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物的影響

由圖2可知，隨著反應溫度的升高，DPPH清除率呈現出先增大后減小的趨勢，反應溫度為50 ℃的DPPH清除率最大，即大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物的反應溫度為50 ℃時為最優反應條件。

2.1.3 反應時間對大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物的影響

由圖3可知，隨著反應時間的增加，DPPH清除率呈現出先增大后減小的趨勢，反應時間為80 min的DPPH清除率最大，即大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物的反應時間為80 min時產量最優。

圖3 反應時間對大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德 反應產物的影響圖

2.1.4 反應pH對大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物的影響

由圖4可知，隨著pH值的增大，DPPH清除率呈現出先增大后減小的趨勢，pH值為4的DPPH清除率最大，即大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物的反應pH值為4時產量最優。

圖4 反應pH對大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德 反應產物的影響圖

2.2 正交試驗結果分析

以DPPH清除率為考察指標，在單因素試驗的基礎上，分別選取大豆分離蛋白∶殼聚糖（質量比）、反應溫度、反應時間以及反應pH 4個影響因素的3個較佳水平，進行L9(34)正交試驗，最終確定最佳反應條件。試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果表

由表2可知，4種因素的主次順序是反應pH＞反應時間＞質量比＞反應溫度，其中反應pH影響程度明顯最大。根據表中的極差分析法可以對最優水平進行判斷，最佳設計方案為A1B2C2D2（46.9%），而由K值分析可知，最佳組合應為A2B2C2D2，因此對兩種組合分別做3次試驗驗證，再求其平均值。試驗驗證結果表明，A1B2C2D2組合條件下的美拉德反應產物DPPH清除率為46.3%，A2B2C2D2組合條件下的美拉德反應產物DPPH清除率為為48.7%，因此A2B2C2D2為最佳條件，即最佳反應條件為大豆分離蛋白∶殼聚糖（質量比）1∶1，反應溫度50 ℃，反應時間 80 min，反應pH 4。

2.3 大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物功能特性的測定

2.3.1 乳化活性的測定結果

根據公式（2）計算樣液的乳化活性，結果如圖5所示。大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物會透析成不同分子量的反應產物，分子量為3 500～8 000 Da的DPPH清除率較高，即該階段的反應產物乳化活性較好。分子量＜3 500 Da和分子量＞8 000 Da的美拉德反應產物的DPPH清除率相差不多，其乳化活性相似。

圖5 乳化活性的測定結果圖

2.3.2 乳化穩定性的測定結果

根據公式（3）計算樣液乳化穩定性，結果如圖6 所示。大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物會透析成不同分子量的反應產物，3 500～8 000 Da的美拉德反應產物的DPPH清除率較高，即該階段的反應產物乳化穩定性較好。

圖6 乳化穩定性的測定結果圖

2.3.3 起泡性的測定結果

按公式（4）計算樣液起泡度，結果如圖7所示。大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物會透析成不同分子量的反應產物，3 500～8 000 Da的美拉德反應產物的DPPH清除率較高，即該階段的反應產物起泡度較好。分子量＜3 500和分子量＞8 000的美拉德反應產物的DPPH清除率相差不大，其起泡度 相似。

按公式（5）計算樣液起泡穩定性，結果如圖8所示。大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物會透析成不同分子量的反應產物，3 500～8 000 Da的美拉德反應產物的DPPH清除率較高，即該階段的反應產物起泡穩定性較好。分子量＜3 500 Da和分子 量＞8 000 Da的美拉德反應產物的DPPH清除率相差不大，其起泡穩定性相似。

圖7 起泡度的測定結果圖

圖8 起泡穩定性的測定結果圖

2.3.4 溶解性的測定結果

利用公式（6）計算溶解度，結果如圖9所示。大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應產物會透析成不同分子量的反應產物，3 500～8 000 Da的美拉德反應產物的DPPH清除率較高，即該階段的反應產物溶解性較好。分子量＜3 500 Da和分子量＞8 000 Da的美拉德反應產物的DPPH清除率相差不大，其溶解性相似。

3 結論

本試驗以大豆分離蛋白和殼聚糖為原料在反應釜內進行美拉德反應，使大豆分離蛋白得到化學改性，使其功能特性得到提高。實驗結果表明，不同的物料比、反應溫度、反應時間和反應pH都會影響大豆分離蛋白與殼聚糖美拉德反應產物的生成，由單因素試驗和正交試驗得出最佳反應條件為大豆分離蛋白∶殼聚糖（質量比）1∶1、反應溫度50 ℃、反應時間80 min、pH 4。該研究結果將為大豆分離蛋白-殼聚糖美拉德反應的制備起到指導性作用。利用上述試驗結果，進行反應產物的制備，并用透析袋進行透析得到不同分子量（＜3 500 Da、3 500～8 000 Da、＞ 8 000 Da）的美拉德反應產物，進行功能特性的分析。結果表明3 500～8 000 Da的美拉德反應產物的乳化活性、乳化穩定性、起泡性以及溶解性最高， 而＜3 500 Da 和＞8 000 Da的美拉德反應產物的各個功能特性相近。美拉德反應是蛋白質化學改性的天然方法，能夠使其功能特性得到一定程度的提高。