比那甫西顆粒的指紋圖譜及含量測定方法研究*

蔡曉翠，丁曼，李俊，陳菊，賀金華

(1.新疆維吾爾自治區藥物研究所，烏魯木齊 830004；2.新疆銀朵蘭藥業股份有限公司，烏魯木齊 830000)

比那甫西顆粒，由天山堇菜、玫瑰花、盒果藤、甘草浸膏、司卡摩尼亞脂、阿里紅六味藥組成。處方是根據現代中醫藥理論及維吾爾醫理論組成的復方制劑，在和田地區和喀什地區的醫院臨床使用已有20多年，具有清除體內異常體液質、清腦、止頭痛、化痰止咳的功效，多用于治療熱性感冒[1]。比那甫西顆粒針對熱性(干熱、濕熱)感冒1487例療效觀察，總有效率為85%。近年的臨床結果統計，比那甫西顆粒70%用于熱性感冒，30%用于其他適應證引起的發熱、咳嗽等病癥，具有顯著良好的臨床效果，并已取得醫療機構院內制劑的批準文號。

目前，比那甫西顆粒質量標準僅有薄層鑒別項，無含量測定項，不夠全面科學，不同批次制劑的質量難以準確評價，質量不穩定和不均一，缺乏有效的質量控制手段。因此，本研究對制劑進一步深入研究，首次以處方中主要藥材特征性成分為基礎，建立比那甫西顆粒的對照指紋圖譜；以制劑中君藥天山堇菜和玫瑰花的主要成分和處方比例較高甘草浸膏的主要成分為指標，建立了秦皮乙素、沒食子酸和甘草酸銨的含量測定方法，提升了制劑的質量標準，為該品種生產過程及質量控制提供依據。

1 儀器與材料

1.1儀器 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；CPA-225D電子天平(Sartorius公司，感量：0.01 mg)；安捷倫TC C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；AS-10250BDT型超聲清洗儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2材料 比那甫西顆粒，編號S1～S12，批號分別為：Y170521、Y170641、20190308、20190315、20190307-1、20190307-2、20190316、Y190501、Y190502、Y170638、Y170642、Y180921，新疆銀朵蘭藥業股份有限公司。沒食子酸(批號：110831-201605，含量90.8%)、秦皮乙素(批號：110741-201708，含量99.9%)、甘草酸銨(批號：110731-201619，含量93%)以上對照品，均購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、秦皮乙素、甘草酸銨對照品適量，加50%甲醇溶液制成每毫升分別含2.47，3.75，5.80 mg的混合對照品儲備液。精密量取混合對照品儲備液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇溶液至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備 精密稱定本品1.0 g，置燒瓶中，加50%甲醇溶液20 mL，稱定質量，加熱回流提取45 min，放冷，用50%甲醇溶液補重，搖勻，取上清液濾過，取續濾液，即得。

2.1.3陰性樣品溶液的制備 按比那甫西顆粒處方工藝，分別制備不含天山堇菜、玫瑰花和甘草浸膏的陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.05%磷酸溶液為B，按表1中規定進行梯度洗脫；檢測波長272 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序 Tab.1 Mobile phase gradient elution procedure

2.3方法學考察

2.3.1精密度試驗 取“2.1.1”項的混合對照品溶液，依“2.2”項測定，以甘草酸銨峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD。結果相對保留時間RSD<1.0%，相對峰面積RSD<4.5%。表明該儀器精密度良好。

2.3.2穩定性試驗 取比那甫西顆粒(批號：Y170521)1.0 g，依“2.1.2”項處理，在10 ℃下放置 0，2，4，8，12，24 h時，依“2.2”項測定，以甘草酸銨峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD。結果相對保留時間RSD<1.0%，相對峰面積RSD<4.5%。表明供試品溶液在10 ℃放置24 h內穩定。

2.3.3重復性試驗 取比那甫西顆粒(批號Y170521)6份，各1.0 g，按“2.1.2”項處理，依 “2.2”項測定，記錄峰面積，以甘草酸銨峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD。結果相對保留時間RSD<1.0%，相對峰面積RSD<5.0%。表明該方法重復性良好。

2.4特征圖譜的質量評價

2.4.1特征圖譜的建立及共有峰的標定 取12批比那甫西顆粒樣品(S1～S12)，依“2.1.2”項處理，依“2.2”項測定，記錄色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(2012版)” 軟件進行色譜峰匹配，樣品S1的色譜圖設為參照圖譜，經多點校正和峰匹配，生成對照圖譜，共標定21個共有峰。結果見圖1。

S1～S12.12批比那甫西顆粒；R.對照。圖1 12批比那甫西顆粒的指紋圖譜 S1-S12.twelve batches of binafuxi granules；R.Reference.Fig.1 Fingerprints of 12 batches of binafuxi granules

2.4.2色譜峰歸屬分析 分別取S1樣品、玫瑰花藥材、天山堇菜藥材、甘草浸膏、缺玫瑰花陰性樣品、缺天山堇菜陰性樣品和缺甘草浸膏陰性樣品，依“2.1.2”項制備供試品溶液，依“2.2”項色譜條件測定，記錄色譜圖，結果見圖2。結果表明，21個共有峰中，1，5，12號峰來自玫瑰花，2，4，21號峰來自天山堇菜，3，7，9，10，11，15，16，17，18，19，20號峰來自甘草浸膏，6號峰來自玫瑰花、天山堇菜和甘草浸膏，8號峰來自玫瑰花和甘草浸膏，13號峰來自司卡摩尼亞脂，14號峰來自甘草浸膏和盒果藤。通過比對各個峰的保留時間、紫外吸收光譜，確定各個峰的歸屬。其中1，4，5，9，18號峰分別為沒食子酸、秦皮乙素、綠原酸、甘草苷、甘草酸銨。其中甘草酸銨峰的峰面積最大、含量最高，故選用18號峰作為參照峰(S)。

A.供試品；B.天山堇菜藥材；C.玫瑰花藥材；D.甘草浸膏藥材；E.不含天山堇菜陰性樣品；F.不含玫瑰花陰性樣品；G.不含甘草浸膏陰性樣品。圖2 供試品、藥材與陰性樣品色譜圖 A.sample；B.viola tianshanica maxim；C.rose；D.licorice extract；E.negative sample without viola tianshanica maxim；F.negative sample without rose；G.negative sample without licorice extract.Fig.2 HPLC chromatograms of sample，herband negative samples

2.4.3相似度評價 將12批樣品的HPLC指紋圖譜數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件進行相似度評價。結果12批樣品與對照指紋圖譜的相似度均大于0.9，具有相似性，表明比那甫西顆粒的生產工藝穩定。

2.4.4聚類分析 采用SPSS21.0版統計學軟件對12批次比那甫西顆粒指紋圖譜的21個共有峰相對峰面積進行聚類分析，采用組間聯結法，度量標準為歐式平方距離，結果見圖3。結果表明，S3，S5，S8，S9，S12為一類，S1，S2，S10，S11為一類，S4，S7，S6單獨為一類，說明不同產地、不同時期的藥材對制劑的質量有一定的影響。

圖3 12批比那甫西顆粒聚類分析結果 Fig.3 Cluster analysis result of 12 batches of binafuxi granules

2.4.5主成分分析 將12批樣品的21個共有峰相對峰面積導入SIMICA-P11.5版軟件進行主成分分析，前3個成分的累計方差貢獻率為81.005%，表明前3個主成分能夠包含比那甫西顆粒色譜的主要信息。主成分分析得分圖見圖4，其中主成分1主要來自2，7，8，14，15，主成分2主要來自3，10，16，17，18，21，主成分3主要來4，5，6，21，結果表明，S1，S2，S10，S11為一大類，S3，S4，S5，S6，S7，S8，S9，S12為另一大類，與聚類分析結果相似。見表2。

圖4 12批比那甫西顆粒PCA分析結果 Fig.4 PCA analysis result of 12 batches of binafuxi granules

表2 主成分分析結果 Tab.2 Principal component analysis results

2.5含量測定[2-16]

2.5.1色譜條件 色譜柱Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.05%磷酸溶液為流動相B，按表3中規定進行梯度洗脫；檢測波長272 nm(沒食子酸)、344 nm(秦皮乙素)、250 nm(甘草酸銨)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

表3 流動相梯度洗脫程序 Tab.3 Mobile phase gradient elution procedure

2.5.2系統適用性試驗 分別吸取“2.1”項下的混合對照品、供試品溶液和陰性樣品溶液，依“2.5.1”項測定，供試品中3個成分的主峰與相鄰峰均能達到基線分離，分離度>1.5；供試品溶液色譜圖中，在與3個成分對照品色譜峰相應的位置上，有相同保留時間的色譜峰，陰性無干擾。見圖5。

1.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.不含山堇菜陰性對照溶液；D.不含玫瑰花陰性對照溶液；E.不含甘草浸膏陰性對照溶液；1.沒食子酸；2.秦皮乙素；3.甘草酸銨。圖5 5種溶液的HPLC色譜圖 A.mixed reference；B.sample；C.negative sample without viola tianshanica maxim；D.negative sample without rose；E.negative sample without licorice extract；1.gallic acid；2.aesculetin；3.ammonium glycyrrhizinate.Fig.5 HPLC chromatograms of five solution

2.5.3提取方法及提取時間考察 本實驗對供試品的提取方法及提取時間進行了篩選，結果加熱回流提取45 min時，3個指標的提取效率最高，故選擇加熱回流提取45 min為供試品提取方法，見表4。

表4 提取方法及時間的考察結果 Tab.4 Investigation results of extraction method and time

2.5.4提取溶劑的考察 本實驗對供試品的提取溶劑進行了篩選，結果提取溶劑為50%甲醇時，3個指標的提取效率相對較高，故選擇50%甲醇溶液為供試品提取溶液，結果見表5。

表5 提取溶劑的考察結果 Tab.5 Investigation results of extraction solvent

2.5.5線性關系考察 分別精密量取“2.1.1”項混合對照品儲備溶液0.1，0.25，0.5，1.0，2.0，2.5 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，依“2.5.1”項測定。以對照品的進樣量(X，μg)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸。沒食子酸、秦皮乙素及甘草酸銨3個成分的線性范圍、回歸方程和相關系數見表6。

表6 3個成分線性方程 Tab.6 Linear equations of three components

2.5.6耐用性考察 本實驗對不同廠家色譜柱(Agilent、Thermo、Cosmosil)、不同柱溫(25，30，35 ℃)，不同流速(0.8，1.0，1.2 mL·min-1)進行了考察，結果不同變動因素對含量測定結果的影響較小，均滿足系統適用性要求，見表7。

表7 3種成分耐用性考察結果 Tab.7 Durability test results of three components

2.5.7精密度實驗 取“2.1.1”項下混合對照品溶液適量，依“2.5.1”項測定，記錄峰面積。結果1～3的峰面積RSD分別為0.59%，0.10%，0.89%，表明實驗所用儀器精密度良好。

2.5.8穩定性實驗 取同一批次供試品溶液(批號：Y180921)，10 ℃下分別于0，2，4，8，12，24 h時，依 “2.5.1”項測定，記錄峰面積。結果1～3的峰面積RSD分別為0.42%，0.43%，1.55%，表明供試品溶液在10 ℃放置24 h內穩定性良好。

2.5.9重復性實驗 取同一批次供試品(批號：Y180921)，按“2.1.2”項方法處理6份，依“2.5.1”項測定，計算1～3的含量。結果1～3含量的RSD分別為1.01%，0.73%，0.39%，表明該方法重復性良好。

2.5.10日間精密度實驗 取同一批次供試品(批號：Y180921)，不同人員在不同日期，按“2.1.2”項處理，按“2.5.1”項測定，計算1～3的含量。結果1～3含量的RSD分別為1.45%、1.56%、0.86%。表明該方法日間精密度良好。

2.5.11加樣回收率實驗 取已知含量的樣品(批號：Y180921)約0.5 g，共6份，分別加入一定質量濃度的沒食子酸、秦皮乙素、甘草酸銨對照品溶液適量，按“2.1.2”項方法處理，依“2.5.1”項測定，計算1～3的平均回收率，分別為102.18%，99.22%，102.04%，RSD分別為0.64%，1.12%，0.80%。

2.612批樣品含量測定 取12批比那甫西顆粒適量，按“2.1.2”項方法處理，依“2.5.1”項測定，計算含量，結果見表8。

表8 樣品含量測定結果 Tab.8 Content determination results of samples mg·g-1

3 討論

3.1色譜條件優化 本實驗對3個成分的對照品溶液和供試品溶液在波長200～400 nm內進行全波長掃描，結果波長為272 nm處供試品色譜峰數最多、基線分離最好，故選擇272 nm為指紋圖譜研究檢測波長；沒食子酸最大吸收波長272 nm，秦皮乙素最大吸收波長344 nm，甘草酸銨最大吸收波長250 nm，因此含量測定方法的檢測波長確定為250，272，344 nm。參考《中華人民共和國藥典》中秦皮乙素、沒食子酸及甘草酸銨的含量測定方法，考慮操作簡便、省時、節約、環保等因素，故選擇3個指標同時測定。采用甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相時秦皮乙素和沒食子酸的峰較寬，乙腈為流動相時3個指標的色譜峰均對稱性好、峰形優，故采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相。

3.2指紋圖譜分析 本實驗建立了比那甫西顆粒的指紋圖譜，確定21個共有峰，鑒定了5個成分。相似度評價結果表明，不同批次的樣品相似度均>0.9，相似性較好，差異較小，表明該制劑具有良好的穩定性。

3.3聚類分析與主成分分析 通過對12批制劑進行聚類分析和主成分分析，發現不同年份生產的制劑各為一類，并篩選出3個主成分，提示在藥物生產過程中需要重點關注該3種成分的變化。

3.4指標成分的選擇 處方中天山堇菜和玫瑰花為君藥，而這兩種藥材現有的質量標準中均無含量測定項，且相關文獻較少。筆者通過標準物質比對及實驗積累經驗確定了該制劑的含量測定指標為秦皮乙素、沒食子酸，控制制劑中天山堇菜和玫瑰花的質量；甘草浸膏占處方比例較大，因此選擇甘草酸銨為含量測定指標，控制制劑中甘草浸膏的質量。

3.5樣品測定分析 比那甫西顆粒12批含量測定結果研究發現，秦皮乙素含量存在較大差別。筆者進一步測定了制劑中所用的天山堇菜藥材，發現藥材中秦皮乙素的含量差異較大，造成了制劑含量的差異性，可能與采摘時間、地點、自然環境、存儲等條件有關。因此，在生產制劑中應重點關注該藥材的質量，保證產品質量的穩定性和一致性。

本研究建立的比那甫西顆粒HPLC特征指紋圖譜分析方法能夠全面系統地反映比那甫西顆粒的質量，并建立了同時測定沒食子酸、秦皮乙素和甘草酸的方法，有效評價出不同批次的制劑質量及需要關注的質量標志成分，提升了該制劑的質量標準，為比那甫西顆粒生產過程的監控提供了理論依據，并為臨床安全有效的應用提供了實驗依據。