施氮量對小麥籽粒淀粉粒的效應

蔡文璐，李 可，簡超群，鄭路敏，唐樹鵬，徐云姬

(1.揚州大學教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室/揚州大學農業科技發展研究院，江蘇揚州 225009；2.江蘇省作物栽培生理重點實驗室/揚州大學農學院，江蘇揚州 225009)

基于小麥穗內籽粒開花日期和粒重的差異，籽粒被分為強勢粒和弱勢粒。通常強勢粒位于麥穗中部，開花早、灌漿快、粒重高；弱勢粒位于麥穗的頂部和基部，開花遲、灌漿慢、粒重低。小麥籽粒淀粉是碳儲藏物的主要形式，約占其最終干重的70%；淀粉以半晶體狀的淀粉粒形式存儲于胚乳中，粒徑大小分界明顯，多呈球體狀或透鏡體狀。一般將成熟小麥的淀粉粒按照粒徑分為3種類型: A型淀粉粒(> 9.9 μm)、B型淀粉粒(< 9.9 μm)和C型淀粉粒(< 2.0 μm)。也有研究按照粒徑將小麥淀粉粒分為小淀粉粒(< 5 μm)、中淀粉粒(5～50 μm)和大淀粉粒(> 50 μm)。小麥的淀粉粒度分布影響著淀粉的理化特性，進而影響小麥籽粒重量和品質性狀。據報道，小麥淀粉粒度分布特征在強、弱勢粒間存在顯著差異，這種差異與籽粒灌漿期可溶性淀粉合成酶(SSS)和顆粒結合性淀粉合成酶(GBSS)的活性及其相關基因表達密切相關。

籽粒淀粉粒度分布特征由遺傳基因和環境條件共同決定。氮肥施用作為最重要的栽培調控措施之一，對小麥籽粒淀粉粒度分布具有重要的調控作用。馬冬云等觀察到，隨著氮肥用量的增加，小麥籽粒中<2.0 μm 和 <9.8 μm 的淀粉粒數量、體積和表面積分布比例呈下降趨勢，而>9.8 μm的淀粉粒數量和表面積分布比例呈增加趨勢。吳培金等發現，在施氮量210 kg·hm內，增施氮肥可降低弱筋小麥品種A型淀粉粒體積和表面積分布比例，提高其B型淀粉粒體積和表面積分布比例，而對A、B型淀粉粒數量百分比無顯著影響。還有學者提出，糯小麥淀粉粒度分布對氮素水平的響應在品種間存在差異。關于施氮量對小麥籽粒淀粉粒度分布影響的報道較多，但是施氮量對小麥強、弱勢粒淀粉粒度分布影響的報道甚少。氮肥調控小麥籽粒淀粉粒度分布的機理研究也較為少見。

多胺(polyamines,PAs)是一類重要的植物內源生長調節物質，常見的有腐胺(putrescine,Put)、亞精胺(spermidine,Spd)和精胺(spermine,Spm)，對植物的生長發育、形態建成及其對環境脅迫響應均具有重要的調控作用。在高等植物中，依據PAs存在的形式，又可分為游離多胺(free-PAs)、可溶性結合多胺和非溶性結合多胺。其中，free-PAs在小麥籽粒中含量較高，是一類重要的活性物質。研究表明，增加小麥弱勢粒中free-Spd、free-Spm含量或其與free-Put比值可以促進籽粒灌漿、增加粒重，在水稻和玉米上也有類似的發現。我們先前發現，free-Spd或free-Spm參與介導小麥花后土壤干旱對強、弱勢粒淀粉粒度分布的調控作用。在輕度土壤干旱條件下，free-Spd或free-Spm可通過增強灌漿期弱勢粒的SSS和GBSS活性來增加籽粒的中淀粉粒(5～50 μm)體積和表面積分布比例或抑制大淀粉粒(> 50 μm)形成。但是，小麥籽粒free-PAs是否參與氮肥對小麥籽粒淀粉粒度的影響分布尚不清楚。

本研究擬測定不同施氮量處理下小麥灌漿期強、弱勢粒中free-PAs含量、淀粉合成酶(SSS和GBSS)活性和成熟期籽粒粒重、淀粉積累量以及淀粉粒數量、長度、體積和表面積分布比例，分析外源PAs對小麥籽粒內源free-PAs含量、淀粉合成酶活性和成熟期籽粒粒重、淀粉積累量以及淀粉粒度分布比例的影響，旨在探明小麥籽粒free-PAs是否介導施氮量對籽粒淀粉粒度分布的調控效應。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗于2020―2021年在揚州大學農學院試驗農場進行。前茬作物為水稻，土壤質地為砂壤土，可耕層含有機質2.04%、堿解氮106.2 mg·kg、速效磷34.2 mg·kg和速效鉀 66.6 mg·kg。供試材料為當地2個主推小麥品種揚麥16和揚麥20。大田種植，全生育期設置4個施氮量處理：(1)施尿素折合純氮120 kg·hm(120N)；(2)施尿素折合純氮180 kg·hm(180N)；(3)施尿素折合純氮240 kg·hm(240N)；(4)施尿素折合純氮300 kg·hm(300N)。2020年11月1日播種，小區面積為28.8 m(6.0 m×4.8 m)，隨機區組排列，3次重復。人工條播，行距30 cm，3葉期定苗，留基本苗 225×10株·hm。氮肥按基肥∶分蘗肥∶拔節肥∶孕穗肥=4∶2∶2∶2施用。播種前一次性施過磷酸鈣(折合純磷90 kg·hm)和氯化鉀(折合純鉀120 kg·hm)，其余田間管理措施參照當地高產田。

1.2 測定指標與方法

小麥開花期各小區選同一天開花、長勢一致的麥穗300個掛牌標記。于花后10 d、20 d和 30 d分別每小區取30個標記穗，剝取強、弱勢粒液氮冷凍10 min后放入-70 ℃超低溫冰箱保存用于free-PAs含量和淀粉合成酶活性的測定(強勢粒是麥穗中部小穗的第1、2位籽粒，弱勢粒是穗頂部和穗基部小穗的第3～6位籽粒)。成熟期各小區取標記穗50個，進行強、弱勢粒粒重和淀粉含量的測定及其淀粉粒度的分析。

1.2.1 游離多胺含量測定

游離多胺[腐胺(free-Put)、亞精胺(free-Spd)和精胺(free-Spm)]的提取與測定方法參照Flores等方法。稱1 g籽粒置于預冷好的研缽中，加5 mL 5%高氯酸研磨至勻漿后放于4 ℃冰箱內2 h，27 000 r·min離心15 min，收集上清液將其苯甲酰化后根據 Tomaso等方法采用HPLC分析free-PAs含量。Put、Spd和Spm作為標準品，1,6-己二胺為內標，重復3次。單位以nmol·gDW表示。

1.2.2 蛋白質含量與淀粉合成酶活性測定

蛋白質含量根據Bradford方法測定。籽粒中可溶性淀粉合成酶(SSS)和顆粒結合性淀粉合成酶(GBSS)活性根據文獻[33]的方法進行測定。淀粉合成酶活性的單位為 nmol·mgprotein·min。

1.2.3 淀粉含量測定、淀粉粒提取及其粒度分析

強、弱勢粒的直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉含量的測定按照雙波長法進行。

淀粉粒提取與純化按Peng等和Ji等方法并稍作改進。提取的粗淀粉在70 ℃烘干后過200目篩后為純淀粉，用激光粒度分析儀進行淀粉粒度分析。取50 mg純淀粉，加5 mL無水乙醇，混勻后置4 ℃冰箱內2 h(需經常振蕩)，吸取2 mL轉移至粒度分析儀的裝有無水乙醇的分散盒中，測量淀粉粒數量、長度、體積和表面積分布特征。結果分析采用儀器本身自帶的軟件，以百分數表示。本研究將小麥淀粉粒分為小淀粉粒(< 5 μm)、中淀粉粒(5～50 μm)和大淀粉粒 (> 50 μm)。

1.3 植物生長調節物質調控試驗

花后6 d分別噴施2 mM Put、1 mM Spd、1 mM Spm、5 mM MGBG(甲基乙二醛雙脒基腙，一種Spd、Spm合成抑制劑)、5 mM MGBG+1 mM Spd于麥穗上。這些外源植物生長調節物質于傍晚連續噴施4 d，每次每穗噴施4 mL，上述各溶液中含0.5%(v/v)Teepol作為表面活性劑。以含相同濃度Teepol的去離子水為對照(CK)。各處理以3 m為一個重復，重復2次。

分別在花后10 d、20 d和30 d測定強、弱勢粒中3種free-PAs含量和2種淀粉合成酶活性。在成熟期分別進行強、弱勢粒的粒重、淀粉含量測定及淀粉粒度分析。

1.4 數據分析

采用Excel 2010和SPSS 16.0進行數據分析、作圖、顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同處理對粒重和淀粉積累量的影響

相同施氮量處理下，兩個小麥品種強勢粒的粒重、直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉積累量都顯著高于弱勢粒(表1)。隨著氮肥施用量增加，兩個小麥品種強勢粒的粒重和淀粉積累量沒有顯著變化，而弱勢粒的粒重和總淀粉積累量呈先升后降的變化趨勢，且均以180N處理的值最高(表1)。不同施氮量間比較，弱勢粒粒重和總淀粉積累量表現為180N>240N>300N/120N，弱勢粒中直鏈淀粉和支鏈淀粉積累量分別表現為240N>300N/180N>120N和180N>300N/240N/120N(表1)。不同施氮量對兩小麥品種粒重和淀粉積累量影響的趨勢一致。

表1 施氮量對小麥成熟期強勢粒和弱勢粒的粒重和淀粉積累量的影響

2.2 不同處理對籽粒淀粉粒度分布的影響

2.2.1 對淀粉粒數量和長度分布的影響

從表2可知，施氮量對兩小麥品種強、弱勢粒的小淀粉粒、中淀粉粒的數量和長度分布均沒有顯著影響；對強勢粒的大淀粉粒的數量和長度分布沒有顯著影響，對弱勢粒中大淀粉的數量和長度分布有顯著效應。弱勢粒的大淀粉粒數量和長度分布比例顯著高于強勢粒。弱勢粒中大淀粉粒數量和長度分布比例均表現為180N<240N<300N/120N。

表2 施氮量對小麥成熟期強勢粒和弱勢粒的淀粉粒數量和長度分布比例的影響

2.2.2 對淀粉粒體積和表面積分布的影響

施氮量對兩小麥品種強、弱勢粒小淀粉粒的體積和表面積分布比例無顯著影響；弱勢粒的中淀粉粒體積和表面積分布比例、大淀粉粒的體積和表面積分布比例顯著低于、高于強勢粒。隨著施氮量增加，弱勢粒的中淀粉粒體積和表面積分布比例呈先升后降的趨勢，具體表現為 180N>240N>300N/120N，強勢粒的中淀粉粒體積和表面積分布比例無顯著變化(表3)，這與粒重和總淀粉積累量變化一致。兩小麥品種強勢粒大淀粉粒的體積和表面積分布比例在不同施氮水平下無顯著變化，弱勢粒的大淀粉粒體積和表面積分布比例均表現為180N<240N<300N/120N(表3)。

表3 施氮量對小麥成熟期強勢粒和弱勢粒的淀粉粒體積和表面積分布比例的影響

2.3 不同處理對籽粒游離多胺含量的影響

由圖1可知，兩小麥品種強勢粒的游離腐胺(free-Put)、亞精胺(free-Spd)和精胺(free-Spm)含量在花后10 d和20 d高于弱勢粒，在花后30 d顯著低于弱勢粒。與free-Put不同，灌漿前期強勢粒的free-Spd和free-Spm含量顯著高于弱勢粒。施氮量對兩小麥品種強勢粒的free-PAs含量和弱勢粒的free-Put含量都無顯著影響。不同施氮水平下，弱勢粒的free-Spd和free-Spm含量表現為180N>240N>300N/120N。

圖1 不同施氮量對小麥灌漿期強勢粒和弱勢粒游離腐胺(free-Put)、亞精胺(free-Spd)和精胺(free-Spm)含量的影響

2.4 不同處理對籽粒淀粉合成酶活性的影響

兩小麥品種強勢粒的2種淀粉合成酶活性在花后10 d、20 d均顯著高于弱勢粒，在花后30 d顯著低于弱勢粒(圖2)。隨著氮肥增施，弱勢粒中2種淀粉合成酶活性先增后降，SSS和GBSS活性分別在180N和240N處理下達最大值，施氮量對強勢粒中2種淀粉合成酶活性無顯著影響(圖2)。施氮量對兩小麥品種籽粒淀粉合成酶活性的影響趨勢一致。

圖2 不同施氮量對小麥灌漿期強勢粒和弱勢粒可溶性淀粉合成酶(SSS)和顆粒結合性淀粉合成酶(GBSS)活性的影響

2.5 淀粉粒度分布比例與粒重、淀粉積累量、游離多胺含量以及淀粉合成酶活性的相關關系

相關分析表明，小淀粉粒的數量、長度、體積和表面積分布比例及中淀粉粒的數量和長度分布比例與粒重、淀粉積累量的相關均不顯著，中淀粉粒的體積和表面積分布比例與粒重、淀粉積累量呈顯著(<0.05)或極顯著(<0.01)正相關，大淀粉粒的數量、長度、體積和表面積分布比例與粒重、直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉積累量均呈極顯著負相關(表4)。

表4 小麥籽粒淀粉粒度分布比例與粒重、淀粉積累量的相關關系

淀粉粒度分布比例與free-PAs含量和淀粉合成酶活性的相關分析表明，小淀粉粒的數量、長度、體積和表面積分布比例以及中淀粉粒的數量和長度分布比例與free-PAs含量和淀粉合成酶活性的相關均不顯著，中淀粉粒的體積和表面積分布比例與free-Spd和free-Spm含量、淀粉合成酶活性呈極顯著正相關，大淀粉粒的數量、長度、體積和表面積分布比例與free-Spd和free-Spm含量、淀粉合成酶活性呈極顯著負相關(表5)。小淀粉粒的數量、長度、體積和表面積分布比例以及中淀粉粒的數量和長度分布比例與free-Put含量的相關不顯著，中淀粉粒的體積和表面積分布比例與free-Put含量呈顯著或極顯著負相關，而大淀粉粒的數量、長度、體積和表面積分布比例與free-Put含量呈極顯著正相關(表5)。

表5 小麥籽粒淀粉粒度分布比例與游離多胺含量、淀粉合成酶活性的相關關系

2.6 籽粒游離多胺含量與淀粉合成酶活性、粒重和淀粉積累量的相關關系

相關分析表明，籽粒free-Put含量與淀粉合成酶活性、粒重和淀粉積累量呈極顯著負相關，free-Spd和free-Spm含量與淀粉合成酶活性、粒重和淀粉積累量呈極顯著正相關(表6)。

表6 小麥籽粒游離多胺含量與淀粉合成酶活性、粒重和淀粉積累量的相關關系

2.7 植物生長調節物質對籽粒相關指標的影響

噴施Put增加了揚麥16弱勢粒的free-Put含量，降低了free-Spd和free-Spm含量；噴施Spd和Spm增加了弱勢粒的free-Spd和free-Spm含量；噴施MGBG增加了弱勢粒free-Put含量，降低了free-Spd和free-Spm含量，且其對籽粒生理活性的影響會因噴施Spd而消除(表7)。噴施Spd、Spm能顯著增加弱勢粒的淀粉合成酶活性、總淀粉積累量、粒重以及中淀粉粒的體積和表面積分布比例，降低弱勢粒的大淀粉粒體積和表面積分布比例；噴施Put的結果與之相反(表7)。除了MGBG，上述植物生長調節物質對揚麥16強勢粒的測定指標無顯著影響(數據未顯示)。

表7 植物生長調節物質對揚麥16弱勢粒相關指標的影響

3 討 論

小麥粒重的形成主要是淀粉合成和積累的過程。研究表明，小麥不同粒位籽粒或強、弱勢粒間的粒度分布存在明顯差異。本研究中，兩小麥品種強勢粒的大淀粉粒數量、長度、體積和表面積分布比例顯著低于弱勢粒，中淀粉粒體積和表面積分布比例均高于弱勢粒；相關分析顯示，中淀粉粒的體積和表面積分布比例與粒重和淀粉積累量呈顯著或極顯著正相關，大淀粉粒的分布比例與粒重和淀粉積累量呈極顯著負相關。這與我們之前的研究結果一致。再次表明，增加小麥弱勢粒的中淀粉粒體積和表面積或減少大淀粉粒形成有望增加其粒重。

有關施氮量對小麥粒重變化的影響，報道不一。在本研究中，兩小麥品種弱勢粒的粒重隨施氮量的增加呈先增后降的趨勢。張 敏等發現，增施氮肥增加了非糯小麥籽粒的B型淀粉粒(< 10 μm)數量占比，而降低了糯小麥籽粒的B型淀粉粒(< 10 μm)占比。馬冬云等報道，增施氮肥可降低小麥籽粒小淀粉粒(< 2.0 μm或 < 9.8 μm)的數量、體積和表面積百分比，增加大淀粉粒(> 9.8 μm)的數量和表面積百分比。吳培金等觀察到，在施氮0～210 kg·hm范圍內，增施氮肥可提高小麥籽粒B型淀粉粒(< 10 μm)的體積和表面積百分比，降低A型淀粉粒(> 10 μm)的體積和表面積百分比。可見，小麥籽粒淀粉粒度分布對氮肥的響應會因品種、施氮量及種植環境等因素的不同而產生明顯差異。目前，關于不同氮肥水平對小麥強、弱勢粒淀粉粒度分布影響的研究，相對較少。本研究中，隨著氮肥增施，兩個小麥品種弱勢粒的中淀粉粒體積和表面積分布比例及大淀粉粒的分布比例分別呈先升后降和先降后升的變化趨勢，而強勢粒的淀粉粒度分布比例無顯著變化(表3)。這與不同施氮量下強、弱勢粒粒重和淀粉積累量的變化趨勢基本一致(表1)。說明180N處理(合理施氮)下弱勢粒粒重、淀粉積累量的提高得益于中淀粉粒體積和表面積分布比例的增加以及大淀粉粒形成的減少。我們也曾觀察到，小麥強勢粒的淀粉粒度分布比例在花后不同干旱處理下也未發生顯著變化，而其弱勢粒的中淀粉粒體積和表面積分布比例以及大淀粉粒的分布比例均發生了改變。說明小麥弱勢粒可能具有較強的可調性，而強勢粒對環境不敏感。

施氮量對小麥籽粒淀粉粒度分布的調控機制尚不清楚。本研究發現，兩小麥品種弱勢粒的free-Spd和free-Spm含量隨著施氮量的增加呈先升后降的變化(圖1)，這與中淀粉粒體積和表面積分布比例的變化趨勢一致，與大淀粉粒粒度分布比例的變化相反。相關分析表明，free-Spd和free-Spm含量與中淀粉粒的體積和表面積分布比例呈正相關，與大淀粉粒的分布比例呈負相關，free-Put與淀粉粒度分布的相關性與之相反(表5)。外源噴施Spd或Spm可顯著增加小麥弱勢粒的中淀粉粒體積和表面積分布比例，降低大淀粉粒的體積和表面積分布比例(表7)。這與我們之前的研究結果相似。Yang等也觀察到，噴施Spd可顯著增加土壤重度干旱條件下小麥籽粒B型淀粉粒(< 10 μm)的體積和表面積分布比例。此外，許多學者也提出，噴施蕓薹素(BR)、赤霉素(GA)或脫落酸(ABA)均能顯著影響小麥籽粒淀粉粒度分布。說明合理施氮條件下，小麥弱勢粒中free-Spd和free-Spm含量的提高可能是其淀粉粒度分布改善、粒重提高的重要原因。之前我們的研究結果顯示，free-Put含量與淀粉粒度分布比例的相關關系不顯著。在本研究中，小麥籽粒free-Put含量與中淀粉粒的體積和表面積分布比例呈負相關，與大淀粉粒的數量、長度、體積和表面積分布比例均呈正相關(表5)；噴施Put可促進小麥弱勢粒的大淀粉粒形成，且具有降低中淀粉粒體積和表面積分布比例的趨勢(表7)。這可能是由供試品種、試驗地點和氣候條件等差異造成的。籽粒free-Put對淀粉粒度分布的調控作用有待進一步研究。本試驗中，兩個小麥品種籽粒的free-Put含量對施氮量水平的響應不顯著(圖1)，推測free-Put不參與介導氮肥對淀粉粒度分布的調控作用。

SSS和GBSS作為淀粉合成過程中的2個重要關鍵酶，與籽粒淀粉粒度分布的形成密切相關。本研究中，小麥籽粒free-Spd和free-Spm含量與SSS和GBSS活性、粒重和淀粉積累量呈顯著正相關(表6)。噴施Spd或Spm可增加揚麥16弱勢粒的2種淀粉合成酶活性、粒重和淀粉積累量(表7)。這與我們之前的報道相同。說明合理氮肥條件下，free-Spd和free-Spm可通過增強小麥灌漿期弱勢粒中的淀粉合成酶活性來增加中淀粉粒體積和表面積分布比例或減少大淀粉粒形成，進而改善其淀粉粒度分布、提高粒重。關于氮肥對籽粒淀粉粒度分布的作用機理仍需深入研究。

4 結 論

兩小麥品種灌漿期弱勢粒中free-Spd和free-Spm含量隨氮肥施用量的增加呈先增后降的變化趨勢，而其free-Put以及強勢粒中free-PAs含量對施氮量無顯著響應。氮肥水平主要影響兩小麥品種弱勢粒的中淀粉粒和大淀粉粒；合理施氮量下，弱勢粒中free-Spd和free-Spm可通過增強淀粉合成酶活性來改善淀粉粒度分布，進而提高粒重。