番茄褪綠病毒病在山東設施西葫蘆上的發生及潛在危害

代惠潔, 燕 穎, 趙 靜, 喬 寧, 張德珍, 竺曉平, 孫小桉

(1. 濰坊科技學院,山東省設施園藝生物工程研究中心, 壽光 262700; 2. 濰坊學院生物與農業工程學院, 山東省生物化學與分子生物學高校重點實驗室, 濰坊 261061; 3. 山東農業大學植物保護學院, 山東省蔬菜病蟲生物學重點實驗室, 泰安 271018)

煙粉虱傳播的番茄褪綠病毒tomato chlorosis virus(ToCV)是一種嚴重危害我國番茄生產的重要新生病毒[1]。該病毒屬長線形病毒科Closteroviridae毛形病毒屬Crinivirus,于1998年在美國佛羅里達州番茄種植區首次被發現[2],隨后迅速在全球范圍內暴發、流行。魏可可等[3]根據文獻統計發現,除南極洲和大洋洲之外,其余5大洲20多個國家和地區均有ToCV的報道。我國于2004年首次在臺灣檢測到ToCV的發生[4],隨后在北京[5]、山東[6-7]、河南[8]、天津[9]、山西[10]、江蘇[11]、遼寧[12]、廣東[13]、湖南[14]等全國各地大范圍發生、流行,造成了嚴重的經濟損失。

ToCV寄主范圍廣,可侵染茄科Solanaceae、菊科Asteraceae、十字花科Brassicaceae等25科85種植物,主要以番茄、茄子等茄科植物為主,尤其對番茄的危害嚴重[15-17]。發病初期葉片脈間黃化,部分區域變紅,發育受阻,輕微卷曲,一般下部老葉先發病,新生枝條和葉片表現正常;隨著病害發展,發生脈間壞死,葉片變厚變脆且易碎、最后干枯脫落;成熟期由于光合作用減弱導致坐果數量減少、果實變小、轉色時間延長,極大降低了品質與產量[18-19]。近年的研究發現,ToCV侵染寄主范圍不斷向其他經濟作物擴大,部分瓜類植物已逐漸成為ToCV新的自然宿主。2014年,Sun等[20]在山東省濟寧市的南瓜溫室內首次檢測到ToCV的發生。2017年王天旗等[21]在湖南省蔬菜研究所基地的黃瓜植株上也發現了該病毒的危害。在我國,瓜類蔬菜的栽培面積較大,ToCV的侵染將會對瓜類生產產生潛在的威脅。

2019年10月,在山東壽光現代農業高新技術試驗示范基地60號溫室內發現了疑似ToCV感染癥狀的西葫蘆葉片,背面伴有大量煙粉虱的發生。通過RT-PCR技術檢測明確了ToCV對西葫蘆的侵染及其在山東省西葫蘆種植區的發生情況,將為有效防控ToCV流行、擴散提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年10月,在山東壽光現代農業高新技術試驗示范基地西葫蘆栽培溫室內發現9株疑似ToCV感病的植株,每株采集上、中、下3片葉,液氮速凍后置于-80℃冰箱用于病毒檢測。同時,在疑似葉片背面采集煙粉虱成蟲100頭,置于裝有95%乙醇的離心管中保存,用于病毒檢測。

為了調查山東省西葫蘆主產區ToCV病毒發生情況,2020年11月在濰坊壽光、濟南長清區和德州德城區設施西葫蘆棚內分別采集疑似ToCV感病樣品17、12份和20份,利用液氮速凍后置于-80℃冰箱,用于病毒檢測。同時,在取樣溫室內各采集煙粉虱成蟲50頭,置入裝有95%乙醇的離心管中保存,用于病毒檢測。

1.2 感病植株ToCV的檢測

取植株葉片0.1 g放入研缽中,加液氮快速研磨,利用TRIzol Reagent法提取葉片總RNA,NanoDrop2000測定RNA濃度。RNA模板根據Thermo Scientific公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書反轉錄合成cDNA,用于后續檢測。根據Dovas等[22]設計的ToCV特異性引物(ToCV-5:5′-GGTTTGGATTTTGGTACTACAT-

TCAGT-3′; ToCV-6: 5′-AAACTGCCTGCATGA-

AAAGTCTC-3′)進行PCR擴增。擴增體系為MasterMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板1 μL,ddH2O 補充至反應體系20 μL。按照94℃ 3 min;94℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃ 1 min,循環30次;72℃ 10 min進行PCR擴增。擴增產物用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,回收目的片段連接到PMD18-T載體上,轉化至大腸桿菌DH5α,陽性克隆委托北京華大基因科技有限公司測序,再進行序列分析。

1.3 煙粉虱成蟲ToCV的檢測

將從田間采集的單頭煙粉虱成蟲置于RNA-free離心管中,加入10 μL TRIzol Reagent研磨提取RNA,采用ToCV特異性引物ToCV-5/6進行PCR檢測。每個樣品重復3次,每次取10頭。

1.4 壽光西葫蘆溫室大棚ToCV發生規律和煙粉虱蟲口數量調查

所調查的壽光西葫蘆大棚位于壽光現代農業高新技術試驗示范基地內,于2020年9月5日定植,棚內種植了58壟西葫蘆,壟向由北至南,北邊為土墻,南邊為塑料薄膜并裝有通風用60目防蟲網;壟距為1.2 m、株距為0.8 m、每壟種植19～21株西葫蘆。

隨機選取20壟做病情調查,觀察植株生長情況并分別在定植時和定植后的1個月、2個月和4個月統計具有ToCV癥狀的植株。

隨機選取6壟西葫蘆做煙粉虱數量調查,每壟由北向南的第5、10、15株和20株自上而下的第3片葉定時定葉觀察記錄煙粉虱數量。

1.5 數據分析

病情和蟲口數量的數據以總的平均數來計算病株率和蟲口數量。

利用統計軟件PASW Statistics18進行統計分析,對不同處理間的差異進行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan氏多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 疑似感病植株的田間癥狀

田間采集的疑似感病西葫蘆植株葉片的葉脈發綠,脈間出現不同程度的褪綠發黃,部分下部葉片變厚變脆,葉片邊緣呈現輕微卷曲(圖1),其表現的部分癥狀與ToCV引起的番茄植株的發病癥狀類似[17,19],且葉片背面發現煙粉虱,推測田間西葫蘆植株可能被ToCV侵染。溫室內西葫蘆的葉片呈現不同的發病癥狀,伴隨果實出現綠色斑駁、凹凸不平,有可能存在其他多種病毒共同侵染的情況。

圖1 西葫蘆植株的病毒病癥狀Fig.1 Viral symptoms of zucchini plants

2.2 田間疑似樣品的ToCV檢測

利用ToCV的特異性引物對田間采集的9份疑似ToCV病毒病植株葉片進行RT-PCR檢測,結果表明其中5份植株葉片均可檢測到463 bp的目的片段(圖2)。將特異性目的片段回收并連接到PMD18-T載體,挑單克隆菌落送華大基因科技有限公司測序。測序結果在NCBI經BLAST比對后,發現該目的片段與GenBank中登錄的ToCV序列(登錄號:KC887998.1)同源性高達99.58%,說明該西葫蘆樣品已被ToCV侵染,檢測出的西葫蘆植株葉片表現ToCV典型癥狀。

圖2 疑似感病西葫蘆植株ToCV的RT-PCR檢測結果Fig.2 RT-PCR testing results of ToCV in suspected infected zucchini plants

2.3 壽光西葫蘆溫室大棚ToCV發生動態和煙粉虱蟲口數量調查

選取20壟西葫蘆植株進行ToCV感染植株調查后,根據ToCV典型癥狀統計結果表明,西葫蘆幼苗在定植時沒有表現任何病毒病癥狀,但定植1個月后,有2%的植株表現ToCV癥狀,定植2個月后,表現癥狀的植株達到4.2%,定植4個月后,表現ToCV癥狀的植株率已高達68.2%,呈指數型的快速增長,其發病率與定植后的月數呈指數性相關,相關系數為0.897,經F雙樣本方差分析,其相關性在0.001水平上顯著(圖3)。

圖3 西葫蘆定植后不同月數里顯示ToCV類似癥狀的植株率及其相關性Fig.3 ToCV symptomatic plant rate at different time points (month)after planting and their correlation

溫室內西葫蘆植株上煙粉虱蟲口數量共調查5次,分別是在2020年10月26日、10月28日、11月3日、11月10日和2021年1月5日進行。結果表明,在第一次調查時煙粉虱蟲口數量最大,所調查植株第3葉的平均蟲口數量達到12.4頭,最大的蟲口數量出現在最靠近南邊防蟲網的第20株西葫蘆上，為41.7頭(圖4)。由于蟲口數量較大,10月27日在南端的5株西葫蘆葉片正反兩面噴施無公害生物制劑CitruSolv?C-100 50倍液(Global BioClean Inc., Bredenton, Florida, USA)進行了區域性綠色防控。在10月28日的調查中發現,第20株上的蟲口數量下降到11.7頭,且后續的調查中發現,其平均蟲口數量保持在5.5～7.7頭。從溫室內所調查植株第3葉的煙粉虱平均蟲口數量看,噴施無公害生物制劑C-100防控煙粉虱后的4次調查中,平均蟲口數量變化不大,維持在3.5頭左右(圖4)。

圖4 不同調查日期西葫蘆植株第3葉上的煙粉虱平均蟲口數量Fig.4 Average numbers of Bemisia tabaci on the 3rd leaf of zucchini plants at different survey dates

2.4 不同地區植株帶毒情況檢測

為了調查ToCV對山東省各地西葫蘆的侵染情況,我們在濰坊壽光、濟南長清和德州德城分別采集疑似ToCV病毒感染樣品17、21、20份。利用RT-PCR檢測發現,3個地區的樣品均可獲得463 bp的特異性擴增片段,與陽性對照一致,說明這些樣品中含有ToCV。在采集的各地樣品中,濰坊壽光地區的ToCV檢出率最高,為52.9%;濟南為32%;德州為29.1%,這說明ToCV在山東上述地區的西葫蘆種植中可能已普遍發生(圖5)。

圖5 山東省不同地區西葫蘆樣品的ToCV帶毒情況Fig.5 Detection rates of ToCV in zucchini samples from different areas in Shandong

2.5 煙粉虱體內ToCV帶毒情況檢測

在濰坊壽光、濟南長清和德州德城的疑似發病植株上各采集煙粉虱成蟲10頭,提取單頭煙粉虱的RNA,重復3次。利用RT-PCR檢測發現,3個地區的煙粉虱體內均可檢測到463 bp的特異性片段(圖6),與陽性對照一致,表明煙粉虱體內攜帶ToCV病毒。其中,濰坊壽光溫室內采集的煙粉虱帶毒率為56.7%,濟南長清為41.5%,德州為48.1%(圖7)。

圖6 部分煙粉虱成蟲體內ToCV的 RT-PCR檢測Fig.6 RT-PCR detection of ToCV in some Bemisia tabaci adults

圖7 煙粉虱成蟲ToCV檢出率Fig.7 Detection rates of ToCV in Bemisia tabaci adults

3 討論

ToCV是世界范圍內發生的一種新興植物病毒,主要危害番茄、茄子等茄果類蔬菜。由于媒介昆蟲的暴發流行,該病毒也不斷擴大其地理和宿主范圍[17],成為蔬菜安全生產的新威脅。本研究于2019年10月在山東壽光的西葫蘆暖棚內發現疑似ToCV癥狀的發病植株,該植株上的顯癥葉片經RT-PCR檢測后確認感染了ToCV。通過對濰坊壽光、濟南長清和德州德城的西葫蘆設施種植區采樣檢測發現,ToCV的檢出率均在29%以上,這說明該病毒病在山東省3個設施西葫蘆主產區已普遍發生,但對露天種植及其他設施種植區的危害情況還需進一步調查。研究發現,ToCV極易與多種植物病毒發生復合侵染,如番茄黃化曲葉病毒tomato yellow leaf curl virus(TYLCV)[23]、番茄斑萎病毒tomato spotted wilt virus(TSWV)[24]、番茄侵染性褪綠病毒tomato infectious chlorosis virus(TICV)[25]等。多種病毒的復合侵染一般會產生拮抗或協生作用,而協生作用往往有利于突破寄主抗性,導致新的病害發生和流行[26]。Tang等[27]在海南番茄和黃瓜溫室周邊的雜草上檢測到ToCV和瓜類褪綠病毒cucurbit chlorotic yellows virus(CCYV)的復合侵染。本研究采集的西葫蘆樣品疑似感染病毒病癥狀存在一定差異,利用特異性引物發現部分樣品被粉虱傳播的瓜類褪綠病毒cucurbit chlorotic yellows virus(CCYV)和蚜蟲傳播的黃瓜花葉病毒cucumber mosaic virus(CMV)侵染(數據待發表)。研究發現,病毒的復合侵染會提高媒介昆蟲對病毒的傳毒效率,促進病毒在田間的傳播[28]。因此,對瓜類蔬菜進行ToCV監測將有利于控制該病毒的發生和流行,阻止其寄主范圍的擴大。

ToCV是韌皮部限制性病毒,自然條件下,依靠媒介昆蟲煙粉虱、溫室白粉虱Trialeurodesvaporariorum和紋翅粉虱T.abutilonea的口針刺破植物韌皮部細胞以半持久性方式進行傳播[2,29-30]。在我國,煙粉虱已經逐漸取代了溫室白粉虱,成為田間的優勢種群[31]。本研究發現西葫蘆棚內采集的煙粉虱攜帶ToCV病毒的概率高達40%,是ToCV傳播的主要傳毒介體。從ToCV感病植株和煙粉虱蟲口數量調查的數據上看,調查后期棚內西葫蘆ToCV發病率呈指數式快速增長,而蟲口數量在這個階段維持較低密度。由此可見,ToCV病毒病一旦在西葫蘆溫室中發生,該病毒并不需要較大的蟲口數量就能迅速蔓延并造成嚴重危害。這種情況與煙粉虱傳毒效率高、遷飛性強有關,也極有可能和農事操作、人工采果對煙粉虱造成驚擾等因素有關。

黃瓜、西葫蘆等瓜類蔬菜是山東省設施農業的特色支柱產業之一,而瓜類蔬菜病毒病的普遍發生已經成為制約高品質高產量瓜類生產的重要因素[32]。且設施西葫蘆的環境因素相對穩定,一旦煙粉虱和瓜果蔬菜的病毒病同時發生,如果不加以有效的控制,其病情很可能在短期內迅速發展并造成極大的危害。因此,設施內種植瓜果蔬菜的過程中,農戶們應該認識到病毒病一旦發生后的嚴重性,嚴格選用無病毒無蟲媒種苗,完善和使用能夠有效地阻斷粉虱和其他遷飛性害蟲進入的防蟲網,定期在棚內進行病蟲害調查,及時采取措施防止病蟲害的發生和蔓延,真正地做到防患于未然。