廣東省江門市‘新會(huì)柑’葉斑病病原菌鑒定

崔一平, 彭埃天, 宋曉兵, 陳 霞, 程保平, 凌金鋒

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南果蔬綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510640)

‘新會(huì)柑’Citrusreticulata‘Chachiensis’又稱茶枝柑,屬于蕓香科柑橘屬,是廣東省江門市新會(huì)區(qū)著名的土特產(chǎn),中國地理標(biāo)志產(chǎn)品之一。‘新會(huì)柑’果皮儲(chǔ)藏的時(shí)間越久越好,存期3年及以上的稱為陳皮。陳皮具有重要的食用價(jià)值和藥用價(jià)值,是我國最常用的中藥品種之一[1]。

目前我國已經(jīng)報(bào)道的柑橘真菌性葉斑病種類達(dá)30余種,如鏈格孢Alternariaalternata引起的柑橘褐斑病和柑橘黑腐病,柑橘葉點(diǎn)霉菌Phyllostictacitricarpa引起的柑橘黑斑病,疫霉Phytophthorapalmivora和P.nicotianae引起的柑橘褐腐病等[2-7]。2018年5月到6月期間,筆者在廣東省江門市新會(huì)區(qū)‘新會(huì)柑’種植園進(jìn)行病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn),很多柑橘葉片上出現(xiàn)葉斑病的癥狀,主要表現(xiàn)為不規(guī)則的、帶有黃色暈圈的棕褐色斑點(diǎn),且在幼嫩葉片上較多,嚴(yán)重影響柑橘葉片的光合作用等功能,從而影響柑橘樹體的營養(yǎng)吸收和果實(shí)的產(chǎn)量、品質(zhì)。

為明確引起‘新會(huì)柑’葉斑病的病原菌,采集發(fā)病的葉片進(jìn)行組織分離和致病性測定,并采用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合多序列系統(tǒng)發(fā)育分析對分離所得的病原菌進(jìn)行鑒定,以期明確引起該病害的病原菌,為病害的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物:2018年春季分別在廣東省江門市新會(huì)區(qū)的3個(gè)‘新會(huì)柑’種植園中,從10個(gè)枝條上選取10片發(fā)病‘新會(huì)柑’葉片進(jìn)行葉斑病病原菌的分離鑒定;健康‘新會(huì)柑’植株購自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所,后種植于溫室滅菌土壤中,在自然光照下進(jìn)行培養(yǎng)。

培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司,稱取40.1 g,加去離子水定容至1 000 mL;高壓鍋121℃滅菌20 min。馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose,PD)培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司,稱取24 g,加去離子水定容至1 000 mL;高壓鍋121℃滅菌20 min。

試劑及儀器:動(dòng)植物全基因組DNA提取試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司;PCR試劑2×EasyTaqPCR Super Mix (-dye) 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;核酸水平電泳槽(Mini-Sub Cell GT Cell1704406,伯樂,美國)、微量離心機(jī)(Thermo Scientific Heraeus Pico 17/21 Fresco 17/21,Thermo Scientific,美國)、T100TMPCR儀購自上海凌儀生物科技有限公司;帶數(shù)字相機(jī)(Leica DFC450)的光學(xué)顯微鏡(Leica DM2500)及其軟件LAS v. 4.5.0 software package (Leica)購自廣州市德靈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1病原菌的分離與形態(tài)特征觀察

本文采用常規(guī)的組織分離法[8]對病原菌進(jìn)行分離鑒定:首先選取感病葉片,用剪刀在病健交界處剪取0.2 cm×0.2 cm左右的小塊,并依次于70%乙醇中30 s,2%NaClO 2～3 min進(jìn)行表面消毒,最后用無菌水沖洗3～5次,置于無菌濾紙上在超凈臺(tái)中晾干,置于PDA平板上在25℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)3 d。本次共分離獲得8株真菌菌株。分別挑取各平板上菌落的單孢子接種于新的PDA平板上繼續(xù)培養(yǎng)10 d后,于顯微鏡下對分離所得菌株的菌絲和孢子形態(tài)及大小進(jìn)行鏡檢,每個(gè)菌株至少觀察15～20個(gè)視野。

1.2.2致病性測定

在PD液體培養(yǎng)基中對XH1菌株進(jìn)行過夜振蕩培養(yǎng),用血球計(jì)數(shù)法制成濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液。選取3株健康‘新會(huì)柑’植株,采用滴接法對離體葉片進(jìn)行刺傷接種,每株上選2片葉,每片葉1～4個(gè)接種點(diǎn);同時(shí)采用相同的方式在另外3株健康‘新會(huì)柑’植株葉片上滴接無菌水作為對照;并放置在27°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),相對濕度為75%,L∥D=12 h∥12 h。接種后,每天對‘新會(huì)柑’的發(fā)病癥狀進(jìn)行觀察和記錄,直至出現(xiàn)與‘新會(huì)柑’葉斑病田間相似的癥狀為止。

1.2.3病原菌的分子生物學(xué)鑒定

以分離獲得的代表菌株XH1的全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將培養(yǎng)10 d純化菌株的菌絲和孢子從PDA平板上刮下,迅速用液氮研磨。根據(jù)動(dòng)植物全基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。選取ITS(ITS1:5′ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和LSU基因(LR5F:5′-ATCCTGAGGGAAACTTC-3′,LROR:5′-ACCCGCTGAACTTAAGC-3′)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[9-10]。反應(yīng)體系:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性40 s,53℃退火30 s,72℃延伸30 s, 34個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。取7 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測,并對獲得的陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序;將獲得的序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對分析,同時(shí)利用MegAlign 7.1.0(44)軟件建立‘新會(huì)柑’葉斑病病原菌菌株XH1的系統(tǒng)發(fā)育樹,從而確定其分類地位;引物合成及測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘新會(huì)柑’葉斑病田間癥狀及其病原菌形態(tài)特征

通過2018年5月至6月的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),‘新會(huì)柑’葉斑病易發(fā)生在高濕高溫的環(huán)境中。該病發(fā)病初期,受侵染的植株葉片上出現(xiàn)棕紅色小點(diǎn)且?guī)в兴疂n癥狀,而后逐漸擴(kuò)展為帶有黃色暈圈的不規(guī)則棕紅色至褐色病斑,且病斑集中發(fā)生在幼嫩葉片的葉尖和葉緣,葉中部也有零星發(fā)生,老葉上發(fā)生較少。在調(diào)查的3個(gè)果園中,發(fā)病最重的為占地8 hm2的果園,大約有1/3柑橘植株的葉片上出現(xiàn)不同程度的病斑(圖1a);隨著時(shí)間的推移,整個(gè)葉片干枯脫落。

對采集的10個(gè)病樣進(jìn)行常規(guī)的組織分離,共獲得8株真菌菌株。經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),其中7株菌株的生長模式一致,我們依次命名為XH1～7。XH1～7的菌落在PDA平板上均為圓形,最初粉紅色,而后逐漸變?yōu)辄S色且菌絲濃密; 分生孢子單生、圓柱形、淺棕色、基部鈍圓或稍尖、光滑或具微疣、具有1～3個(gè)橫隔和許多縱隔且在中間橫隔膜處縊縮; 分生孢子的長度為33.4～52.7 μm,寬為10.8～16.6 μm (n=30),初步鑒定XH1～7屬于匍柄霉屬Stemphyliumsp.(圖1b～e),因此本研究選取其代表菌株XH1進(jìn)行后續(xù)研究。另一株菌株的菌落呈現(xiàn)白色,圓形,在顯微鏡下能夠觀察到明顯的鐮刀狀大孢子和卵圓形小孢子,確定XH8為鐮刀菌屬Fusariumsp. 真菌(由于在后續(xù)人工接種試驗(yàn)中, XH8不能在‘新會(huì)柑’葉片上引起病害,故在此不做多敘)。

2.2 菌株XH1的致病性測定

接種菌株XH1的孢子懸浮液3 d后,健康‘新會(huì)柑’植株的葉片上出現(xiàn)針尖狀深褐色水漬狀小點(diǎn);15 d后接菌‘新會(huì)柑’植株葉片上的發(fā)病癥狀與田間發(fā)病癥狀相似。從接種發(fā)病的葉片上可再分離獲得單一的與原接種菌株在培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征上相一致的病原菌。根據(jù)柯赫氏法則,菌株XH1為‘新會(huì)柑’葉斑病的致病菌(圖1f)。

2.3 菌株XH1的分子生物學(xué)鑒定

以XH1的gDNA為模板,采用引物ITS1/ITS4和LR5F/LROR進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別得到539 bp和871 bp的片段。通過膠回收和測序后,將得到的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對,發(fā)現(xiàn)菌株XH1(ITS:MZ165336;LSU:MZ165337)與番茄匍柄霉Stemphyliumlycopersici(ITS:MH863236;LSU:MH874764)的同源性分別為100%和99.89%。基于XH1獲得的ITS和LSU序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),菌株XH1序列與番茄匍柄霉的遺傳距離最近,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及分子鑒定結(jié)果確定引起‘新會(huì)柑’葉斑病的病原菌為番茄匍柄霉S.lycopersici(圖2)。

圖2 基于ITS和LSU序列,構(gòu)建‘新會(huì)柑’葉斑病原菌XH1及相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(最大似然法)Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on ITS and LSU sequences of XH1 and related strains by using maximum likelihood method

3 討論

本研究確定了引起‘新會(huì)柑’葉斑病的病原菌為番茄匍柄霉S.lycopersici,這是在我國乃至全世界首次報(bào)道番茄匍柄霉在‘新會(huì)柑’上引起病害。已有報(bào)道表明,番茄匍柄霉可以在酸漿Physalisalkekengi和夏日菊Zinniaelegans上引起葉斑病等[11-12]。有關(guān)引起‘新會(huì)柑’葉斑病病原菌番茄匍柄霉的侵染機(jī)制和病害防治措施等方面仍需進(jìn)一步的研究。