向日葵鏈格孢的分類研究

魏 昕, 查晴辰, 楊姝祺, 劉豐銀, 趙 林, 鄧建新*

(1. 長江大學農學院, 荊州 434025; 2. 福建農林大學植物保護學院, 福州 350028)

油葵HelianthusannuusLinn.是菊科向日葵屬的一年生高大草本植物,為世界第二大油料作物。葵花籽可壓榨出低膽固醇的高級食用葵花油。由于其中含有66%的亞酸油,被譽為21世紀“健康營養油”[1]。此外,榨油后剩余的殘渣是很好的蛋白質飼料。油葵的種植成本低,管理簡單,產量高,含油量好,抗逆性強,已作為特色油料作物被納入我國重點種植產業中,目前陜西省已擁有大量油葵示范基地[2-3]。并且,油葵的經濟價值越來越受重視,市場需求進一步提升。然而,在大面積種植油葵時,病害發生的可能性增高,若防治不當,會造成巨大經濟損失,所以對其病害的監測、鑒定、預防和防治尤為重要。

油葵常見的病害有菌核病、黑斑病、褐斑病、葉枯病、霜霉病等[4]。其中黑斑病在油葵種植區普遍發生,主要病原菌為鏈格孢Alternariaspp.,該菌危害花盤、莖和葉等多個部位,對油葵產量造成極大損失,一般年減產10%～20%,嚴重時減產可達50%以上,甚至絕收[5]。目前世界上已報道與向日葵黑斑病相關的鏈格孢共有11種,為鏈格孢Alternariaalternata、紅花鏈格孢A.cathami、向日葵鏈格孢A.helianthi、侵染向日葵鏈格孢A.helianthinficiens、A.heliophytonis、白花菊鏈格孢A.leucanthemi、A.protenta、A.roseogrisea、細極鏈格孢A.tenuissima、瘤鏈格孢A.tuberculata和百日菊鏈格孢A.zinniae。中國已報道的有7種,包括A.alternata、A.helianthi、A.helianthinficiens、A.leucanthemi、A.tenuissima、A.tuberculata和A.zinniae,其中向日葵鏈格孢A.helianthi為優勢種[6]。向日葵鏈格孢首次由Hansford于1943年在烏干達發現,并命名為Helminthosporiumhelianthi[7],1969年Tubaki將其更名為A.helianthi[8]。目前世界各地,如印度、日本、中國、美國等國均有報道[9]。

本研究從陜西省華陰市油葵葉片黑斑病樣品上分離純化得到病原菌菌株,檢測其致病性,并從形態學和分子生物學特征進行鑒定,明確其種類及分類地位,為向日葵黑斑病病原菌的分類研究及防治提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試菌種來源

2017年9月于陜西省華陰市采集油葵葉斑病病害樣本,切取病健交界處組織,利用保濕培養的方法進行單孢分離[10]。將純化后的菌種編號并保存于長江大學植物病理學實驗室。致病性檢測后,選取YZU 171766和YZU 171770進行后續研究。

1.1.2培養基

PDA:馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose broth,Difco,USA)24 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL。

PCA: 馬鈴薯20 g,胡蘿卜20 g,蒸餾水1 000 mL。

1. 2 試驗方法

1.2.1形態學鑒定

菌落形態:供試菌株在PDA上培養3～5 d后,在菌落邊緣取3個菌齡一致的菌絲塊接種于直徑90 mm的PDA培養基上(呈正三角分布),在25℃黑暗條件下培養7 d,描述菌落形狀,顏色等,并測量菌落直徑。

孢子形態:取少量菌絲接種于PCA上,在22℃,L∥D=8 h∥16h的條件下培養7 d[11]后觀察產孢表型和分生孢子形態等,并隨機選取50個分生孢子進行測量。

1.2.2分子系統學鑒定

供試菌株在PDA上培養5～7 d后,刮取適量菌絲體至1.5 mL離心管中適當研磨,然后采用改良CTAB法提取DNA[12]。以提取的DNA為模板,對供試菌株YZU 171766和YZU 171770的ITS (ITS5/ITS4)[13]和LSU(LROR/LR5)[14]基因進行PCR擴增。采用25 μL的反應體系,含2×TaqPCR StarMix(北京擎科生物科技有限公司)21 μL,DNA模板2 μL,引物(10 μmol/L)各1 μL。擴增條件為95℃預變性3 min；94℃變性40 s,(ITS: 55℃;LSU: 50℃)復性1 min,72℃延伸1 min,32個循環；72℃延伸10 min。PCR產物用含有1%核酸染料(Golden View,北京博邁德基因技術有限公司)的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,將目的條帶產物進行正反引物測序(北京擎科生物科技有限公司)。

利用BioEdit軟件對測序成功的序列進行校對，獲得完整序列。登錄NCBI網站利用BLAST進行同源性比對分析,找出相似性最高的菌株,在GenBank數據庫或參考文獻中選取模式菌株或代表菌株作為參考(基因登錄號見表1),確保所構建系統發育樹的準確性。利用jPHYDIT[15]軟件對所選參考序列與本研究序列進行比對,并在MEGA 7.0[16]軟件中對兩個基因序列進行拼接合并,最后利用RAxML[17]軟件進行最大似然法分析(maximum likelihood:ML)并構建系統發育樹,利用GTRCAT模型計算1 000次分析獲得bootstrap支持率(BP)。

1.2.3致病性檢測

供試菌株在PCA上產生分生孢子后,利用無菌水洗脫分生孢子,過濾離心,再配制成濃度為5×105個/mL的孢子懸浮液。取20 μL的孢子懸浮液滴于干凈健康的油葵葉片中心(株齡30～60 d,株高30～40 cm),以無菌水作為對照,置于保濕裝置中培養,每天觀察并記錄發病情況,每個菌株設3個重復。對發病部位的病原菌進行再次分離,并與原分離物進行比對,完成科赫式法則驗證。上述試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 油葵黑斑病危害癥狀及致病性檢測

油葵黑斑病可危害向日葵多個部位,主要以葉片為主,從下部葉片開始發病并逐漸向上部蔓延。受害葉片常見圓形或不規則的黑褐色病斑,病斑周圍常伴有亮黃色暈圈,條件適宜時病害發展迅速,后期病斑連成大片導致整個葉片枯萎死亡(圖1a)。該病也可發生在葉片和葉柄相連部位,直接導致葉片枯萎,最終脫落。

將供試菌株的分生孢子懸浮液接種于健康的油葵葉片后,第3天接種部位出現褐色的小斑點,隨后逐漸擴大,病斑呈黑褐色圓斑,中央呈灰白色,邊緣有少量黃色暈圈,接種點略有皺縮,與田間發病癥狀一致。7 d后測量病斑直徑,菌株YZU 171766所致病斑直徑一般為8.5～16.5 mm,少數可達20 mm,菌株YZU 171770病斑直徑8.0～13.5 mm。兩菌株所致癥狀相似(圖1),YZU 171766引起癥狀略顯嚴重。從葉片發病部位分離獲得的病原與原接種物一致,表明分離物為油葵黑斑病病原菌。

圖1 油葵黑斑病田間癥狀及致病性檢測Fig.1 Symptom of black spots on Helianthus annuus in the field and pathogenicity tests

2.2 形態學

兩株病原菌YZU 171766和YZU 171770菌落生長均緩慢,菌落直徑較小,產孢量較為豐富,而菌落形態和孢子形態略有不同，其中YZU 171766的菌落生長速度較快,分生孢子較短。

菌落形態:在PDA上培養7 d,菌株YZU 171766(圖2a)菌落白色,氣生菌絲毛氈狀,培養基表面形成致密的菌落,中央突起,向外延伸，扁平,邊緣不規則,背面顏色偏灰白,直徑15～16 mm。菌株YZU 171770(圖2e)菌落呈灰色,在培養基表面形成致密的菌落并結塊,質地偏硬,難以戳破,中央突起,周圍扁平,反面深灰色偏深綠色,邊緣白色,菌落直徑5～6 mm。

孢子形態:在PCA培養基中培養7 d,分生孢子梗單生,直立或略彎,淺黃褐色近無色,分隔,基部略微膨大。菌株YZU 171766分生孢子梗(15～75)μm×(5～9)μm,有0～3個隔膜(圖2b,c);菌株YZU 171770分生孢子梗(20～44)μm×(5～9)μm,有0～4個隔膜(圖2f, g)。分生孢子單生或鏈生兩個孢子,直立或稍微彎曲,圓柱狀、長橢圓形,初期無色,后顏色逐漸成淡黃褐色,兩端鈍圓且無喙,有隔處略微縊縮,有明顯的臍點。菌株YZU 171766分生孢子(29～119)μm×(8～31)μm,有3～10個橫隔膜,0～3個縱斜隔膜(圖2d)。菌株YZU 171770分生孢子(42～179)μm×(14～37)μm，有3～12個橫隔膜,0～4個縱隔膜(圖2h)。

圖2 向日葵擬鏈格孢菌株YZU 171766和YZU 171770的菌落和分生孢子形態特征Fig.2 Colonies and conidial morphology of Alternariaster helianthi YZU 171766 and YZU 171770

2.3 系統發育分析

供試菌株YZU 171766和YZU 171770的ITS和LSU基因序列在NCBI網站進行同源性比對后發現,其與已報道的向日葵擬鏈格孢Alternariasterhelianthi(曾用名:向日葵鏈格孢Alternariahelianthi)的一致性均達99%以上。將ITS和LSU基因序列拼接合并后總共有1 120個堿基(ITS含547個,LSU含573個)。借助GenBank數據庫和參考文獻選取31個相關菌株(分別來自5個不同的科)進行系統發育分析(表1),最大似然法構建的系統發育樹見圖3,節點處顯示最大似然法分析支持率(BP)≥60%的數據。

表1 構建系統發育樹的菌株信息及GenBank登錄號Table 1 Strains and their GenBank accession no. used in the phylogenetic analysis

續表1 Table 1(Continued)

在構建的ML系統發育樹中,供試菌株YZU 171766和YZU 171770與向日葵擬鏈格孢Alternariasterhelianthi聚為一簇(BP=99%),其中YZU 171770與CBS 134018等5個菌株形成一個聚類分支(BP=68%), 而YZU 171766呈現在不同的分支上。通過比對,兩個菌株的LSU基因序列完全相同,ITS基因序列有2個堿基不同。通過5個相關的科(小球腔菌科Leptosphaeriaceae、盾殼霉科Coniothyriaceae、葫蘆霉科Cucurbitariaceae、亞隔孢殼科Didymellaceae、格孢腔菌科Pleosporaceae)構建系統發育樹,結果顯示擬鏈格孢屬Alternariaster屬于小球腔菌科,不屬于格孢腔菌科。擬鏈格孢屬的3個種Alternariasterhelianthi、Al.bidentis和Al.centaureae-diffusae聚于一支,BP為100%。其中Al.helianthi和Al.bidentis的親緣關系更近,聚為一支(BP=99%)。而與Al.helianthi形態相似的白花菊鏈格孢Alternarialeucanthemi與鏈格孢Alternariaalternata聚為一支(BP=100%),屬于格孢腔菌科的鏈格孢屬Alternaria,與小球腔菌科系統發育關系較遠。

3 結論與討論

2003年,張天宇在《中國真菌志:鏈格孢屬》中對向日葵鏈格孢Alternariahelianthi進行了詳細的描述[19]。該菌與白花菊鏈格孢Alternarialeucanthemi同為向日葵的重要病原菌,形態學上較為相似,可形成單生,直立,無喙,蠕蟲狀的分生孢子,孢子橫徑和橫隔膜數作為其區分依據[19]。白花菊鏈格孢的寄主有馬蘭Asterindicus[6]、大濱菊Leucanthemummaximum[11]和向日葵[18-19],分生孢子長度<100(～120)μm,橫徑<25 μm,橫隔膜數最多可達17個(表2)。向日葵擬鏈格孢的寄主只有向日葵,分生孢子長度最大可達179 μm,橫徑可達41 μm,橫隔膜數最多可達12個(表2)。由此可見,向日葵擬鏈格孢與白花菊鏈格孢相比,其分生孢子主橫隔少、鮮見增厚,孢身較長,橫徑較寬,且孢壁顏色更淡。然而,它們形態和產孢表型都與Alternaria的其他種有較大差別,其分類地位一直以來都未引起人們的重視,張天宇等[20]建議應將二者獨立為新屬。2007年Simmons對鏈格孢屬的形態學進行詳細系統的分類研究后,發現向日葵鏈格孢菌中不存在像鏈格孢菌中常見的顯著且顏色較深的環痕(分生孢子梗產孢細胞的產孢孔和分生孢子基部細胞的著生點),并置于新屬擬鏈格孢屬Alternariaster,更名為Alternariasterhelianthi[11]。本研究利用形態學將所分離的油葵黑斑病病原菌鑒定為向日葵擬鏈格孢Alternariasterhelianthi。

基于ITS和LSU基因序列分析,向日葵擬鏈格孢與鏈格孢屬的系統學關系較遠(圖3)。鏈格孢屬真菌屬于子囊菌的格孢腔菌科,而向日葵擬鏈格孢屬于小球腔菌科。此結果進一步從分子系統學上證明了Simmons[11]形態學結果,原稱為向日葵鏈格孢Alternariahelianthi應屬于擬鏈格孢屬Alternariaster真菌,為Al.helianthi的曾用名。本研究結果與Alves等[18]和Woudenberg等[21]的結果一致。由于缺乏參考菌株,且形態學重要可區分特征認識不足,小球腔菌科Leptosphaeriaceae的分類研究一直存在一定的問題[20]。Alves等[18]于2013年首次報道Alternariaster屬的另一個新種Al.bidentis,分生孢子孢身較短(50～98 μm),橫徑較窄(<20 μm),容易與Al.helianthi區分開來。此外,Al.bidentis的分生孢子沒有斜或縱隔膜,在菌落上可觀察到性孢子器(spermogonia),而Al.helianthi沒有這些現象。至此,Alternariaster屬共包含兩個種Al.helianthi和Al.bidentis,且均未觀察到有性態特征。隨后,Ariyawansa等[22]在矢車菊Centaureadiffusa枯死的莖上發現了一個有性態新種Al.centaureae-diffusae,但未觀察到其無性態特征。到目前為止Alternariaster屬共包含上述3個種類。向日葵鏈格孢Alternariahelianthi國際上雖已更名為Alternariasterhelianthi,但我國仍在延續使用前者,為了避免造成國內后期分類混亂,本研究中從形態學和分子系統學兩方面對其進行分析研究,將該菌命名為向日葵擬鏈格孢Alternariasterhelianthi,以期在未來能科學地統一起來。

圖3 基于ITS和LSU基因序列利用最大似然法構建的油葵黑斑病病原菌系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the pathogenic fungus causing black spots on Helianthus annuus based on ITS and LSU gene sequences using maximum likelihood

我國對向日葵黑斑病的研究主要集中在20世紀80年代,近十年來,國內外對油葵黑斑病的研究報道極少,2014年我國學者發現向日葵黑斑病病原菌大部分是Alternariaalternata,而未發現其優勢種Alternariasterhelianthi[23]。可見,向日葵黑斑病的優勢病原可能發生變化,急需進行多方面的調查研究[24]。然而,由于其菌落生長速度緩慢,在組織培養中很容易被其他生長速度快的真菌覆蓋(如Alternariaalternata),而不容易被觀察到,建議使用保濕培養的方法進行觀察和分離[10]。此外,本研究結果表明在形態學上Alternariasterhelianthi種內存在一定的差異性。菌株YZU171766在菌落大小、顏色和分生孢子長寬均與YZU 171770不同,然而兩株菌對油葵的致病力差異不大,該結果為向日葵黑斑病的病原學和防控等相關研究奠定了基礎。