香菇多糖調控自噬對高糖誘導HUVEC損傷的保護作用及機制

楊巧薇， 倪環宇， 吳 麗，梅洪梁1，

(1.南京中醫藥大學鼓樓臨床醫學院，江蘇 南京 210000； 2.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院藥學部，江蘇 南京 210008； 3.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023； 4.南京臨床藥學中心，江蘇 南京 210008)

糖尿病是一種有著持續高血糖癥狀的代謝性疾病[1]。機體的慢性高血糖狀態是導致血管內皮功能異常的重要因素，最終可能導致血管病變，引起眼、腎臟、神經和心血管系統的并發癥[2]，給患者造成身體和經濟上的負擔，因此了解血管病變發生的機制及時防治糖尿病血管病變是改善糖尿病并發癥的有效途徑。血管內皮細胞(vasuclar endothelial cell，VEC)是心血管系統的第一層屏障[3]，在血管病變中起著關鍵作用。血糖濃度過高誘導VEC發生氧化應激，使其分泌的細胞因子水平失調，引起細胞損傷和組織病變[4]。細胞內低水平的自噬可以降解部分氧化應激產生的代謝廢物和受損的細胞器。而高血糖狀態下，內皮細胞的自噬水平無法降解持續產生的多余代謝廢物，過量活性氧累積、炎癥體激活，多種細胞器功能受損，最終結果即是細胞死亡，血管病變開始發生。因此，靶向自噬治療以減輕糖尿病血管病變有重要意義。

香菇多糖(lentinan，LNT)是從中藥香菇中提取的活性成分，符合糖尿病血管病變的治療法則。有研究顯示LNT能調控自噬[5]，減輕活性氧(reactive oxygen species，ROS)和過量一氧化氮(nitric oxide，NO)對膈肌線粒體的損傷[6]。

但目前尚未見LNT對VEC保護作用的相關研究。基于此，本研究以高糖(high concentration of glucose，HG)誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)制備糖尿病狀態下VEC損傷的病理模型[7]，研究在HG損傷條件下LNT對HUVEC的保護作用以及相關機制，為糖尿病血管病變的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞HUVEC購自江蘇恩莫阿賽生物技術有限公司。

1.2 藥物純度98%的LNT粉末購自北京索萊寶科技有限公司(批號SL8730)。

1.3 試劑香菇多糖粉末(純度98%，北京索萊寶科技有限公司，貨號：SL8730)；純度50%的無菌葡萄糖注射液(北京雷根生物技術有限公司，批號0615A20)；DMEM無糖培養液、DMEM高糖培養液、胎牛血清(FBS)、胰酶、PBS(美國Gibco公司，批號分別為8120075、8114146、1619679、2186956、8120233)；BCA試劑盒、ROS檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為120219200629、213620200912、102620201202、073120201204、PA667)；TUNEL試劑盒(美國Everbright公司，批號323D0101)；兔源GAPDH抗體、兔源誘導型一氧化氮合酶(iNOS)抗體、兔源T-p38 MAPK抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，批號00074988、00085538、00076424)；兔源p-p38 MAPK抗體(美國Affinity公司，批號79d6101)；辣根過氧化物(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗(英國Abcam公司，批號GR313248-1)；CCK-8試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司，批號C0001261)。

1.4 儀器MCO-15AC型CO2細胞培養箱(日本Sanyo公司)；Synergy H1型多功能微孔板檢測儀(美國BioTek公司)；TDZ4-WS臺式低速離心機(中國湘儀集團)；SW-CJ-1F型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；微孔板恒溫振蕩器(杭州奧盛儀器有限公司)；熒光倒置顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；307352型電泳儀、化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司),Thermo NanoDrop One/One c超微量紫外分光光度計,ABI7500實時熒光定量PCR儀。

1.5 細胞培養在37 ℃、5% CO2條件下應用DMEM高糖培養基培養HUVEC，培養基中含10% FBS、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素。每隔1～2 d換液，實驗采用對數生長期的細胞(融合度70%～80%)進行。

1.6 藥物工作液的配制

1.6.1LNT工作液 取LNT 20 mg，溶解于8 mL DMEM無糖培養基配制成濃度為25 g·L-1的母液，于4 ℃下保存；使用前，用DMEM無糖培養基稀釋至相應濃度的工作液。

1.6.2HG溶液的配制 取2.592 mL葡萄糖溶液，稀釋于25 mL無糖DMEM培養基中，配制成濃度為240 mmol·L-1的HG母液，于4 ℃下保存，使用時按需用DMEM無糖培養基稀釋至相應濃度的工作液。

1.7 CCK-8法檢測HUVEC活力

1.7.1HG對HUVEC活力的影響 取處于對數生長期的HUVEC，胰酶消化后以含FBS的高糖DMEM培養基制備細胞懸液，將細胞以每孔約5 000個接種于96孔板，每孔細胞懸液體積為100 μL。HUVEC培養8～12 h貼壁后，隨機分為空白對照組和HG不同濃度處理組(40、80、120、160 mmol·L-1)，再設置一組添加DMEM培養基，不含細胞的A0組，每組重復6個孔。棄去原先孔板中的培養基，無菌PBS洗滌后，各組加入含不同濃度HG且無FBS的DMEM培養基，空白對照組和A0組加入無糖無FBS的DMEM培養基。繼續培養24 h后，棄去上清液，每孔加入含10%CCK-8的DMEM單培100 μL。2 h后應用酶標儀于波長450 nm處檢測光密度(OD值)，將空白對照組的OD值設置為細胞活力100%，計算各組的相對細胞活力。實驗重復6次，取平均值。

1.7.2LNT對HUVEC活力的影響 細胞培養和種板方法同上，設置空白對照組和LNT不同質量濃度處理組(50、100、200、400、800 mg·L-1)，以及A0組(含培養基但不含細胞)加入LNT后培養24 h，檢測方法同上。實驗重復6次，取平均值。

1.7.3HG誘導損傷條件下，LNT對HUVEC活力的影響 細胞培養和種板方法同上，設置6個實驗組：空白對照組、HG損傷模型組、HG+LNT低劑量組(200 mg·L-1)、HG+LNT中劑量組(400 mg·L-1)、HG+LNT高劑量組(800 mg·L-1)、以及A0組，加藥后培養24 h，檢測方法同上。實驗重復6次，取平均值。

1.8 DCFH-DA探針法檢測HUVEC胞內ROS水平設置5個實驗組：空白對照組、HG損傷模型組、HG+LNT低劑量組(200 mg·L-1)、HG+LNT中劑量組(400 mg·L-1)、HG+LNT高劑量組(800 mg·L-1)，將HUVEC細胞按2×108·L-1接種于6孔板，加藥培養24 h后，棄去上清，無菌PBS洗滌后加入DCFH-DA稀釋試劑(按1 ∶1 000用不含血清的DMEM培養基稀釋)，DCFH-DA工作濃度為10 μmol·L-1，置于細胞培養箱中37 ℃孵育20～30 min。用無血清的培養基洗滌3次后，在熒光顯微鏡下觀察各處理組熒光強度，熒光強度與胞內ROS水平呈正比。應用ImageJ 1.8.0軟件分析圖像，將空白對照組的熒光強度設置為100%。實驗重復6次，取平均值。

1.9 黃嘌呤氧化酶法、硫代苯巴比妥酸法檢測HUVEC的SOD、MDA水平分組方法同“1.8”，加藥培養24 h后，裂解細胞，按照試劑盒說明書操作。實驗重復6次，取平均值。

1.10 MDC染色法檢測HUVEC的自噬水平設置6個實驗組：空白對照組、HG損傷模型組、HG+LNT低劑量組(200 mg·L-1)、HG+LNT中劑量組(400 mg·L-1)、HG+LNT高劑量組(800 mg·L-1)、雷帕霉素(rapamycin，RAPA)陽性對照組。將HUVEC細胞按2×108個·L-1接種于6孔板，HG誘導損傷后，分別加入200、400、800 mg·L-1LNT處理，陽性藥對照組加100 nmol·L-1RAPA。24 h后，加入50 μmol·L-1MDC孵育20 min，熒光顯微鏡觀察拍照。應用ImageJ 1.8.0軟件分析圖像，將空白對照組的熒光強度設置為100%。實驗重復6次，取平均值。

1.11 PCR法檢測HUVEC自噬相關基因Beclin-1表達水平設置分組同1.10。細胞培養種板方法同上，給藥培養24 h后，加入TRIzol和氯仿進行mRNA提取，將mRNA逆轉錄成cDNA，進行濃度測定后點板上機檢測自噬相關的基因Beclin-1，引物序列見Tab 1。

Tab 1 Specific primer sequences for PCR

1.12 Western blot技術檢測HUVEC胞內相關蛋白的表達細胞種板培養方法同上，各組細胞加藥培養24 h后，棄去上清，用PBS清洗后，在6孔板中加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液90 μL。冰上充分裂解后，在4 ℃，12 000 r·min-1條件下離心20 min，取上清總蛋白液進行BCA法定量。將各組蛋白濃度調至統一后，100 ℃水浴鍋中煮10 min，將蛋白變性。上樣時各組取等量樣本，進行SDS-PAGE分離后轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h。加入一抗4 ℃孵育過夜。用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(TBST)溶液洗滌5次，每次10 min，隨后孵育二抗，于室溫孵育1 h。TBST清洗5次后采用ECL顯影液顯色，于化學發光成像系統成像。應用ImageJ 1.8.0軟件分析圖像的灰度值，以GAPDH為內參計算所測蛋白的表達水平。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 CCK-8實驗確定HG、LNT作用的最佳濃度

2.1.1HG作用濃度篩選 不同濃度HG培養液作用于HUVEC后，與對照組相比，當HG的工作濃度為120 mmol·L-1時，HUVEC開始出現活力明顯下降(P<0.01)，如Fig 1A所示；HG工作濃度達到180 mmol·L-1時，HUVEC活力下降程度約為正常對照組的一半(P<0.01)。這提示120 mmol·L-1的HG能引起適度的HUVEC損傷，后續實驗選取120 mmol·L-1作為HG誘導HUVEC損傷的工作濃度。

2.1.2LNT對正常細胞無影響 僅用LNT處理HUVEC并不影響細胞活力，這提示LNT對HUVEC不存在明顯的細胞毒性，見Fig 1B。

2.1.3LNT提高HG損傷下的細胞活力 與空白對照組相比，僅用120 mmol·L-1的HG處理HUVEC降低了細胞活力(P<0.01)；應用不同濃度LNT與HG共處理HUVEC時，與HG單獨處理組相比，當LNT濃度達到400 mg·L-1和800 mg·L-1時，能明顯改善HG誘導的HUVEC活力下降(P<0.01)，見Fig 1C。這說明對于HG誘導的HUVEC活力下降，LNT能起到一定的改善作用。

2.2 LNT抑制HG誘導ROS的產生與空白對照組相比，HG的處理增加了HUVEC胞內ROS水平(P<0.01)。同時與HG損傷組進行比較，LNT劑量依賴性地緩解HG引起的ROS增加，400 mg·L-1作用后差異有統計學意義(P<0.05)，見Fig 2。這說明LNT可有效改善HG誘導的HUVEC胞內ROS堆積。

Fig 2 Effects of LNT on intracellular ROS level of HUVECs induced by HG **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs HG.

2.3 LNT調節HUVEC內SOD、MDA水平緩解氧化應激120 mmol·L-1的HG可明顯降低HUVEC胞內SOD含量(P<0.01)，增加MDA含量(P<0.01)。不同劑量LNT的處理能明顯改善HG誘導的SOD降低，并呈劑量依賴性。同時400 mg·L-1的LNT即可有效降低HG引起的MDA水平增加(P<0.01)，見Fig 3。

Fig 3 SOD and MDA level of

2.4 LNT抑制HG誘導損傷下HUVEC內iNOS蛋白表達與空白對照組相比，HG的處理明顯增強了HUVEC的iNOS蛋白表達(P<0.01)，400 mg·L-1(P<0.05)和800 mg·L-1(P<0.01)的LNT能有效抑制HG引起的iNOS表達增加，見Fig 4。結果說明,LNT能通過減少ROS堆積和iNOS表達改善HG引起的HUVEC胞內氧化應激。

2.5 LNT增加HG損傷下細胞內自噬MDC染色表達與對照組比較，120 mmol·L-1的HG可明顯降低HUVEC胞內自噬水平(P<0.05)。400 mg·L-1、800 mg·L-1LNT都明顯增加MDC染色標記的熒光顆粒水平，見Fig 5。RAPA是自噬誘導劑，此處用作為陽性參照。

Fig 4 Effects of LNT on iNOS protein expression in HG treated HUVECs

Fig 5 Effects of LNT on intracellular autophagy level of HUVECs in HG induced injury

2.6 LNT提高HG損傷下自噬相關基因Beclin-1表達與空白對照組相比，HG的處理明顯降低了HUVEC的Beclin-1基因表達(P<0.01)，400 mg·L-1(P<0.05)和800 mg·L-1(P<0.01)的LNT能增加Beclin-1基因表達，見Fig 6。

Fig 6 Effect of LNT on expression of HUVEC Beclin-1 gene treated with HG

2.7 LNT提高HG損傷下胞內LC3II/LC3I蛋白表達與空白對照組相比，HG的處理明顯降低了HUVEC的LC3II/LC3I的蛋白表達(P<0.001)，400 mg·L-1(P<0.05)和800 mg·L-1(P<0.01)的LNT能有效提高HG引起的LC3II/LC3I表達減少，見Fig 7。這部分結果說明LNT能提高HG誘導損傷下，細胞內的自噬水平。

Fig 7 Effects of LNT on LC3 protein expression in HG treated HUVECs

2.8 LNT降低HG損傷下胞內p38 MAPK磷酸化水平對于HUVEC，HG的刺激可增強p38 MAPK的磷酸化(P<0.001)，LNT的處理能劑量依賴性地改善HG誘導的p38 MAPK磷酸化，200 mg·L-1的劑量即差異有顯著性(P<0.01)，見Fig 8。這部分結果說明，LNT改善HG誘導的HUVEC氧化應激狀態，可能與抑制p38 MAPK信號通路的磷酸化相關。

Fig 8 Effects of LNT on p-p38 protein expression in HG treated HUVECs

3 討論

糖尿病是一個全球性的健康問題，已成為全球十大死亡原因之一，其患者多死于并發癥，其中最常見的是血管病變，因此防治糖尿病血管病變是改善糖尿病并發癥的有效途徑。

糖尿病屬于中醫的“消渴”范疇，在疾病早期，常表現為陰虛肝旺、氣陰兩虛、陰虛燥熱、熱傷氣陰等癥候。在疾病中晚期，出現血管病變等并發癥，其主要病機特征多為氣虛血瘀、經絡閉阻。因此，中醫治療糖尿病及其血管病變，常采用調整臟腑、補虛瀉實、標本兼治的治療法則[8]。藥食兩用藥材香菇具有補虛扶正、益氣健脾的功效，不僅和糖尿病的治療理論相符，還和自噬在傳統中醫理論中的“補虛瀉實”相符合。

近年來，中醫藥對疾病的診治作用在國內外得到廣泛關注和推廣，關于多糖類物質藥理作用的研究有所增多，然而，LNT對于糖尿病血管病變的防治作用和機制尚不明確。本研究通過體外細胞實驗，探究LNT對HUVEC的保護效應。研究結果首次證實了在HG的損傷處理下，LNT對HUVEC的活力有改善作用。

正常生理情況下iNOS蛋白表達量較低，有損傷因素刺激時iNOS表達上調并產生大量NO，可誘導ROS形成，進一步引起脂質過氧化[9-10]。脂質過氧化會使MDA生成增加，胞內ROS和MDA水平呈明顯正相關[11]。SOD活性反映細胞清除ROS的能力，是一種重要的抗氧化酶[12-13]。

在生理條件下，對于細胞內的多余代謝物，胞內維持著一種保守的降解途徑—自噬。此過程通過自噬體的雙膜囊泡將大量細胞質、細胞器(如線粒體和過氧化物酶體)感染因子等在內的代謝廢物傳遞到溶酶體中降解，緩和炎癥反應，防止細胞死亡，保護細胞免受饑餓和相關壓力[14]。而II 型糖尿病是一種常見的與氧化應激相關的多因素疾病，通過活性氧的形成導致高血糖和高脂血癥引起的細胞損傷和胰島素抵抗[15]。在糖尿病狀態下，血管內皮細胞的自噬水平不能維持多余代謝廢物的清除，代謝廢物過度堆積，內皮細胞最終無法維持正常生理功能，血管病變開始發生。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)屬于高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，包含3種亞家族：c-Jun的N末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)、細胞外信號調節激酶(extracellar signal-regulated kinases，ERK)以及p38[16]。不僅與胞內氧化應激狀態密切相關，還作為mTOR下游的關鍵靶點調控著自噬[17]。且調節許多蛋白質、酶和轉錄因子的活性，參與細胞對外部刺激的生物反應，有研究表明，氧化應激在血管內皮損傷的發病機制中起著重要作用，ROS可通過多種途徑誘導p38 MAPK持續活化[18]，活化后參與調控，使細胞內的自噬過程受到抑制，ROS的清除能力下降，二者互相促進、惡性循環，進而造成細胞損傷和活力下降。

本研究發現，HG誘導HUVEC胞內p38 MAPK磷酸化增加，自噬水平受到抑制。LNT作用后可增加HG損傷下細胞內的自噬水平。通過調控自噬可以降低HG引起的HUVEC胞內iNOS蛋白表達、減少ROS和MDA水平，改善HG誘導的SOD水平降低，緩解胞內氧化應激。同時p38 MAPK的磷酸化水平也降低，以上作用均為劑量依賴性。這提示對于HG引起的HUVEC活力下降，LNT可以通過ROS/p38 MAPK通路調控自噬來改善細胞損傷，減緩血管病變的發生。

綜上所述，LNT可能作為防治糖尿病血管病變的候選藥物，從而為延緩糖尿病并發癥的發生發展，提高糖尿病病人的生活質量提供可能性。但自噬的調控是多途徑的，LNT是否僅通過ROS/p38 MAPK通路調控自噬尚不明確，HG刺激HUVEC條件下，LNT對其它自噬相關信號通路的影響尚未闡明，后續本課題組將在此基礎上進一步深入探究。