連翹苷體內外抗病毒及解熱作用機制

郭健敏，富 力，秦麗莉，陳文培，代彩玲，梁 純，吳琪琪，楊 威1,

(1.廣東省科學院動物研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣東 廣州 510260；2.廣東萊恩醫藥研究院有限公司，廣東省藥物非臨床評價研究企業重點實驗室，國家中藥現代化工程技術研究中心中藥非臨床評價分中心，廣東 廣州 510990；3.香港科技大學，香港 999077;4. 大連富生天然藥物開發有限公司,遼寧 大連 116000)

感冒是最常見的急性呼吸道感染性疾病，發生率較高。目前臨床上主要以非甾體類解熱鎮痛藥、甾體類藥物或復方中藥制劑，聯合抗病毒藥物治療感冒[1]。但這些藥物服用后均表現出不同程度的副作用或者僅有解熱、抗病毒某一方面的療效[2-4]。連翹是木犀科(Oleaceae)連翹屬(Forsythia)植物，根據中國古代經典中醫典籍如《本草綱目》、《神農本草經》、《證類本草》等記載，連翹具有清熱解毒、消腫散結和疏散風熱等功效[5]。在中國藥典中，有114種中藥制劑含有連翹的成分。連翹在臨床上對感冒引起的發熱、頭痛和咽喉腫痛等有確切的治療作用，其中連翹苷(phillyrin, KD-1)是連翹的主要活性成分之一，也是中國藥典作為控制連翹藥材質量的重要指標[6]。目前國內外對KD-1的藥理研究主要有抗炎、降血脂、保肝、抗菌、抗病毒及腦神經系統保護方面的作用[7-9]，但其抗病毒和解熱的聯合作用鮮有報道。本研究擬采用不同呼吸道病毒株體外抗病毒模型，評價其體外抗病毒活性，通過流感病毒致小鼠急性肺炎模型和大鼠發熱模型評價KD-1抗病毒、解熱作用，并對其初步作用機制探索，為其在治療流感等感染性疾病臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株及病毒株MDCK、A549、Vero和HEp-2細胞；流感病毒株A/H3N2/Hong Kong/8/68(H3N2)，人單純皰疹病毒HSV-1、HSV-2，人腺病毒3型AdV-3，人呼吸道合胞病毒RSV，人腸道病毒71型EV71，以及流感病毒鼠肺適應株A/H1N1/FM/1/47(FM1)均購于美國ATCC，病毒株經雞胚傳代后保存于-80 ℃低溫冰箱或液氮中。

1.2 動物ICR小鼠，(18～22) g，SD大鼠，(250～300) g，均為SPF級，雌雄各半，來源于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產使用許可證號為SCXK(湘)2013-0004，2013-0006，飼養溫度(21～25) ℃，相對濕度40%～70%，12 h/12 h 明暗交替，級壓差>10 Pa，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2015-0146。本研究動物實驗已獲得廣東萊恩醫藥研究院有限公司實驗動物管理與使用委員會(IACUC)批準。

1.3 藥物及主要試劑連翹苷，由大連富生天然藥物開發有限公司提供，批號：20160401，含量為90.2%；病毒唑注射液，天津藥業集團新鄭股份有限公司，批號：1606151；利巴韋林片，天津藥業集團新鄭股份有限公司，批號：16048402；丙泊酚注射液，廣東嘉博制藥有限公司，規格20 mL,200 mg，批號：1A160210；干酵母，河北馬利食品有限公司，規格500 g/袋，批號：2016.02.01；DMEM培養基，批號：431594，Gibco；胎牛血清，批號SV30087.02，美國HyClone；大鼠白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)，大鼠環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，大鼠前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，大鼠精氨酸加壓素(arginine vasopressin，AVP)，大鼠α黑色素細胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)ELISA檢測試劑盒均購自大連泛邦試劑有限公司。

1.4 主要儀器BSC1600-Ⅱ-B2型生物潔凈安全柜，蘇州凈化設備有限公司；3543型二氧化碳培養箱，美國Thermo；ELx808酶標儀，美國BioTek；ST5020型多功能染色機、病理圖像分析系統，德國LEICA。

1.5 KD-1體外抗病毒活性測定

1.5.1病毒毒力測定[10]將不同濃度(10-4～102PFU·L-1)的病毒液分別接種到96孔板中(長成單層細胞時接種)，流感病毒接種于MDCK細胞，腺病毒接種于A549細胞，皰疹病毒接種于Vero細胞，合胞病毒接種于HEp-2細胞，每個稀釋度設4個復孔。于35 ℃，5% CO2培養5 d觀察細胞情況，根據Reed-Muench法，計算各病毒的半數感染量(TCID50)。

1.5.2KD-1對細胞毒性的測定[11]取對數生長期的細胞分別加入96孔板中，待細胞長成單層后，棄培養液，換含有不同濃度的藥液，置37 ℃、5 % CO2培養箱，培養5 d，用MTT比色法在酶標儀490 nm波長處測定吸光度值(OD值)。計算細胞抑制率，計算半數中毒濃度(TC50)和最大無毒濃度(TC0)。

1.5.3KD-1對病毒致細胞病變作用測試[12]分別加入不同濃度的病毒至細胞中，吸附1 h，用PBS洗去病毒液，加入對細胞無毒的KD-1和病毒唑注射液，每一病毒稀釋度各加4個復孔，同時設病毒對照組，陰性對照組，陽性藥物對照組(病毒唑注射液)。并置于35 ℃ CO2培養箱內培養，連續5 d，在倒置顯微鏡下觀察病變，做好病變記錄。然后用細胞MTT比色法，在酶標儀490 nm波長處測定吸光度值(OD值)，計算KD-1的IC50值和選擇指數(Selection Index，SI)，SI=TC50/IC50，實驗重復3次。

1.6 KD-1對流感病毒感染FM1小鼠所致肺炎的干預60只ICR小鼠適應性觀察3 d，♀♂各半，按體質量和性別隨機分成6組，10只/組。根據等效體表面積換算人的等效劑量，設KD-1劑量設為3.25、6.5、13 mg·kg-1以及正常對照組、模型組和陽性對照組利巴韋林片58.5 mg·kg-1；除正常對照組外，各組均于感染前1 d開始灌胃給藥，連續5 d，正常對照組和模型組給予相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉(0.5% CMC-Na)。各組動物用丙泊酚注射液按12 mg·kg-1淺麻醉，除空白組用生理鹽水外，其余各組滴鼻50 μL小鼠流感病毒感染，感染量為15 TCID50，所有動物于感染后96 h進行解剖，取小鼠的肺進行稱質量，計算肺指數。一部分肺組織勻漿后測定血凝滴度，一部分用于HE染色法觀察肺組織病理變化。肺指數計算公式：肺指數=肺質量/體質量(g/g)。

1.7 KD-1對干酵母誘導SD大鼠發熱的干預[13-14]90只SD大鼠，雄性，除正常對照組外，其余大鼠皮下注射20%干酵母10 mL·kg-1，測定大鼠造模5 h后體溫，再根據選擇體溫升高0.8～2.0 ℃的大鼠隨機分為模型對照組，陽性對照組(對乙酰氨基酚)，KD-1低、中、高劑量組，每組至少9只體溫合格動物。分組后給予相應的藥物10 mL·kg-1，KD-1劑量設為13.5、40.5、121.5 mg·kg-1，空白和模型對照組給予等容積的0.5% CMC-Na。測定動物給藥后1、2 h的體溫，并計算其與基礎體溫的差值(△T)。待動物體溫測定完畢后，動物腹主動脈采血安樂死，取血漿和下丘腦的組織勻漿，雙夾心ELISA法測定IL-1β、cAMP、PGE2、AVP、α-MSH含量。

1.8 KD-1分子對接驗證在PubChem網站通過以“phillyrin”為關鍵詞，得到KD-1的2D、3D化學結構式，保存為“SDF”格式，并將其轉換為“pdbqt”格式；從PDB數據庫和Uniprot數據庫中下載IL-1β、cAMP、PGE2、AVP、α-MSH蛋白結構。利用AutoDock Tools軟件處理該蛋白結構之后，設置對接盒子大小以及對接參數，利用AutoDock vina軟件進行對接。最后通過PyMol軟件的繪制得出對接結果。

1.9 統計學分析采用SPSS 17.0 統計軟件進行數據分析，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結果

2.1 KD-1體外抗病毒活性KD-1可減輕病毒引起的細胞病變程度，對H3N2、HSV-1、HSV-2、AdV-3、RSV和EV71均具有一定的抑制作用，SI值均>2。

2.2 KD-1對流感病毒感染FM1小鼠所致肺炎的影響如Fig 2，與正常對照組相比，模型對照組肺指數明顯增加(P<0.01)；與模型對照組相比，各給藥組的肺指數、血凝滴度均可顯示出明顯降低的趨勢(P<0.01或P<0.05)。

2.3 肺組織病理變化結果如Fig 3所示，模型對照組支氣管腔內大量淋巴細胞浸潤，肺間質增寬，大量炎細胞浸潤，成片肺泡腔實變，肺泡腔內浸潤大量淋巴細胞、中性粒細胞等炎細胞，亦可見大量均只淡然滲出液，呈明顯的滲出性炎癥反應，提示小鼠出現嚴重的病毒性肺炎，造模成功。與模型對照組比較，各給藥組小鼠肺組織病變程度明顯減輕，特別對間質性肺炎改善明顯。

Fig 1 KD-1 showed high anti virus activity in H3N2, HSV-1,HSV-2, AdV-3, RSV and EV71 in vitro cell n=3)

Fig 2 Effects of KD-1 on lung index and blood agglutination titer of FM1 infected n=10)

Fig 3 Effect of KD-1 on lung pathogenesis of FM1 infected mice(HE×100)

Fig 4 Effect of KD-1 on cytokine content in plasma and hypothalamus of dry yeast-induced fever rat

Fig 5 Docking results of KD-1 with 5 related protein molecules

2.4 KD-1對大鼠發熱模型解熱及作用機制解熱作用結果顯示，與正常對照組相比，模型組造模后5 h、給藥后1 h、2 h動物體溫升高值均明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，各給藥組明顯降低1 h、2 h的體溫升高值(P<0.05或P<0.01)，提示著均有明顯的解熱作用。結果如Fig 4所示，與正常對照組相比，模型組血漿AVP含量降低(P<0.05)，IL-1β、cAMP 、PGE2、α-MSH含量未見明顯改變。與模型組相比，對乙酰氨基酚組PGE2含量明顯降低(P<0.05)。KD-1低劑量組AVP、α-MSH含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)。KD-1中高劑量組IL-1β、PGE2、AVP含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與正常對照組相比，模型組下丘腦cAMP含量降低(P<0.05)，IL-1β、AVP、PGE2、α-MSH含量未見明顯改變。與模型組相比，對乙酰氨基酚組PGE2、α-MSH含量明顯降低(P<0.01)。KD-1低、中、高劑量組IL-1β、PGE2含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)。

2.5 KD-1分子對接驗證在PDB數據庫和Uniprot數據庫中得到了以下相關蛋白信息，利用AutoDock Vina分別計算出各個相關蛋白的最低結合能。從表中可以看出KD-1與蛋白的最低結合能均<-5 kcal·mol-1，所需能量越低，說明結合能越好。因此，分子對接結果可以驗證該實驗的研究。

3 討論

流感發生的主要原因是由呼吸道病毒感染，從而引發急性呼吸道感染。越來越多的天然產物以其獨特的多靶點用于預防和治療流感，顯示出良好的作用及其較小的毒副作用而引起了研究者的廣泛關注[15-16]。本研究結果發現，KD-1在TC0條件下對H3N2、HSV-1、HSV-2、AdV-3、RSV和EV71均有一定的抑制作用，而且SI>2，結果提示KD-1是連翹抗呼吸道病毒的有效物質。

Tab 1 Effect of KD-1 on temperature rise of dry yeast-induced febrile rat model

Tab 2 Affinity and target information of KD-1 and inflammatory factors

流感病毒感染可導致炎癥、肺損傷，這些組織病理學方面的改變將增加肺的質量[17]。為了評價KD-1對流感病毒導致的肺損傷的保護作用，本研究選用肺組織的血凝滴度、肺指數和肺組織病理學指標進行KD-1體內抗流感病毒活性的研究。Nguyen等[18]研究發現，KD-1到達體內后可明顯的改善流感病毒所致的小鼠肺組織損傷，從而達到顯著延長小鼠平均存活時間的效果。本研究結果表明：經流感病毒感染后的ICR小鼠，在灌胃給予KD-1后，各給藥組的血凝滴度和肺指數較模型對照組相比明顯減少，提示KD-1可抵抗流感病毒侵蝕肺部，這與Qu等[17]報道的KD-1體內抗流感病毒的研究結果相一致。肺病理組織學顯示KD-1可減輕肺部病變程度，特別是對病毒感染間質性肺炎改善明顯，KD-1對流感的治療可能是通過抗病毒和抗炎兩者共同起效發揮作用。

發熱是病毒感染機體后的一個主要癥狀，而細菌、病毒、炎癥性滲出物等都是常見的外源性致熱源。當外源性致熱源進入機體后，刺激機體產生內源性致熱源，并作用于體溫調節中樞使產熱增加、散熱減少而引起發熱。本研究選用了干酵母致大鼠發熱的模型評價KD-1的解熱作用，并初步的考察其解熱的作用機制。KD-1在給藥后1～2 h對發熱大鼠模型的體溫均有明顯降低的趨勢，表明了KD-1具有明顯的解熱作用。在解熱機制的研究中，選用了體溫調節正向介質IL-1β、cAMP和PGE2，負向調節介質AVP、α-MSH進行相關研究。本試驗結果表明，KD-1對模型大鼠血漿和下丘腦中cAMP含量均未見明顯影響，表明其解熱作用可能不是通過調節cAMP通路發揮的，而KD-1和對乙酰氨基酚均可降低血漿和下丘腦中PGE2的含量。KD-1結構中有與非甾體類藥物類似的結構，因此從構效關系的角度分析KD-1能夠降低PGE2的作用可能與該結構密切相關。

綜上，KD-1具有較好的抗呼吸道病毒的作用，可明顯改善肺組織病毒性間質性肺炎的病變，同時對外源性致熱源誘發的發熱具有明顯的解熱作用，作用機制與降低PGE2和IL-1β等炎性物質和炎癥因子相關。推測KD-1可通過抗病毒、解熱及抗炎的綜合作用“標本兼治”起到抗流感的作用。