二烯丙基二硫通過(guò)miR-7下調(diào)XIAP抑制人胃癌SGC7901細(xì)胞增殖與遷移侵襲

劉 芳，李志敏，曹振華，何 慧，2，蘇 琦，蘇 波，3

(南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院1.腫瘤研究所、湖南省高校腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.應(yīng)用解剖與生殖醫(yī)學(xué)研究所，3.藥物藥理研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001)

X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein ，XIAP)是凋亡抑制蛋白家族主要成員，它參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等惡性表型的調(diào)控[1]。XIAP高表達(dá)與胃癌臨床進(jìn)展、預(yù)后具有相關(guān)性[2]，下調(diào)XIAP表達(dá)可誘導(dǎo)凋亡、抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移侵襲能力[2-4]，提示XIAP可能是胃癌防治藥物的潛在靶點(diǎn)。

二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是從大蒜中提取的一種低毒、有效的抗腫瘤成分[5]，它具有抗胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲作用[6]。我們之前研究DADS處理胃癌細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)XIAP表達(dá)下調(diào)[7]，推測(cè)DADS抗胃癌作用機(jī)制可能與其抑制XIAP表達(dá)有關(guān)。

miR-7在胃癌中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-7抑制胃癌細(xì)胞增殖、增強(qiáng)化療藥物的敏感性[8]。文獻(xiàn)報(bào)道[9]，miR-7在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞負(fù)調(diào)控XIAP表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們用miRNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DADS處理胃癌細(xì)胞后miR-7水平上調(diào)[10]。目前，miR-7在胃癌細(xì)胞是否靶向調(diào)節(jié)XIAP表達(dá)、DADS是否通過(guò)miR-7下調(diào)XIAP尚不清楚。

本研究觀察DADS對(duì)XIAP過(guò)表達(dá)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，明確miR-7在胃癌細(xì)胞對(duì)XIAP的調(diào)控作用，從而闡明DADS通過(guò)miR-7下調(diào)XIAP發(fā)揮抗胃癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DADS(317691)購(gòu)自Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒(PA115)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Total RNA Kit(LS1030)、熒光定量PCR試劑盒(A6001)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(E2920)為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；抗XIAP抗體(ab21278)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；β-actin抗體(TA-09)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光試劑盒(LuminataTM)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；胎牛血清(F8245)為杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品；嘌呤霉素(A11138-02)、Lipofectamine 2000(11668-019)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RT試劑盒(K1622)購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；Matrigel基質(zhì)膠(354230)購(gòu)自美國(guó)BD公司；CCK-8試劑盒(CK04)購(gòu)自日本Dojindo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和XIAP過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建人胃癌SGC7901細(xì)胞由南華大學(xué)腫瘤研究所保存，置于5% CO2、飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱，用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10% FBS)培養(yǎng)。XIAP過(guò)表達(dá)GV358慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建和鑒定，將其與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，鑒定后提取病毒，測(cè)定病毒滴度為3 × 1011TU·L-1，放置-80 ℃凍存。24孔板接種SGC7901細(xì)胞，將病毒感染細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選并獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，qRT-PCR和Western blot驗(yàn)證XIAP表達(dá)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)組分為4組，Vector組、Vector+DADS組、XIAP組、XIAP+DADS組。將細(xì)胞接種于96孔板，每組6個(gè)重復(fù)孔，細(xì)胞分別處理24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h，測(cè)定OD450值。細(xì)胞增殖率/%=[(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)將各組細(xì)胞接種于6孔板中，200個(gè)細(xì)胞/孔，每組3個(gè)重復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，待自然風(fēng)干后用結(jié)晶紫染色。克隆形成率/%=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5 Western blot用細(xì)胞裂解液RIPA提取總蛋白，BCA法檢測(cè)濃度，將各組等量樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，4 ℃孵育一抗過(guò)夜，洗膜后加二抗孵育1 h，洗膜后加ECL發(fā)光液，X片曝光。檢測(cè)灰度值，β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)將各組細(xì)胞接種六孔板，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)用Tip頭劃痕，無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，測(cè)量細(xì)胞遷移距離，Vector組為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)細(xì)胞遷移率。

1.7 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)將各組細(xì)胞懸液加入Transwell上層小室，下室加含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱24 h，用棉簽拭去小室上層膜表面細(xì)胞，4%多聚甲醛固定小室下表面細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇4個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞，計(jì)算平均值。侵襲實(shí)驗(yàn)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同，區(qū)別是在小室上層膜表面鋪上一層Matrigel基質(zhì)膠。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告分析miR-7過(guò)表達(dá)(pHBLV-U6-RFP-T2A-Puro-miR-7，miR-7)和miR-7敲低(pHBLV-U6-RFP-T2A-Puro-miR-7-antago，miR-7-antago)慢病毒載體由上海漢恒生物公司構(gòu)建和鑒定。XIAP 3′ UTR野生型(WT)和突變型(Mut)雙熒光素酶報(bào)告重組GV306載體由上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建和鑒定。將miR-7過(guò)表達(dá)載體與XIAP-WT或XIAP-Mut載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性，以海腎熒光素酶為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)熒光值。

1.9 qRT-PCRXIAP mRNA檢測(cè)：細(xì)胞總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分別按照Total RNA Kit和RT試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用SYBR熒光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行Real-time PCR分析。XIAP：F 5′-GTGGTGGAAAACTGAAAAATTGG-3′，R 5′-GAAAGTGTCGCCTGTGTTCTGA-3′；β-actin：F 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，R 5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′。miR-7檢測(cè)均采用德國(guó)QIAGEN公司試劑盒，miRNeasy kit (#217004)和miScript II RT kit (#218161)分別用于總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄，qPCR使用miScript SYBR Green PCR Kit(#218073)，Hs_miR-7_2 miScript Primer Assay(#MS00032116)和Hs_RNU6-2_11 miScript Primer Assay (#MS00033740)，U6作為miR-7的內(nèi)參。采用ΔΔCT方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 DADS下調(diào)XIAP、抑制XIAP過(guò)表達(dá)胃癌細(xì)胞增殖qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組與空載體組XIAP表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；XIAP組mRNA和蛋白水平明顯高于對(duì)照組和空載體組(P<0.05)(Fig 1A)，表明成功建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)XIAP細(xì)胞株。

我們之前通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)30 mg·L-1DADS下調(diào)胃癌細(xì)胞XIAP[7]，因此本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)采用30 mg·L-1DADS 處理SGC7901細(xì)胞。qRT-PCR和Western blot結(jié)果(Fig 1B)顯示，與Vector組比較，Vector+DADS組XIAP mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，XIAP組XIAP表達(dá)量增高(P<0.05)；與XIAP組比較，XIAP+DADS組XIAP表達(dá)減少(P<0.05)。結(jié)果表明，DADS下調(diào)SGC7901細(xì)胞XIAP表達(dá)，并且DADS抑制過(guò)表達(dá)組XIAP表達(dá)。

如Tab 1所示，與Vector組比較，用30 mg·L-1DADS處理細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞增殖率呈時(shí)間依賴性下降(P<0.01)，而XIAP組增殖率高于Vector組(P<0.05)；XIAP+DADS組增殖率低于XIAP組，但高于Vector+DADS組(P<0.05)。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 1C)顯示，與Vector組比較，Vector+DADS組克隆形成率降低，XIAP組增加；XIAP+DADS組克隆形成率高于Vector+DADS組，低于XIAP組。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)XIAP促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，DADS抑制XIAP過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。

Fig 1 DADS inhibited proliferation of XIAP overexpressed SGC7901 cells via downregulating XIAP expression

Tab 1 Effect of DADS on proliferation of XIAP overexpressed cells (%)

2.2 DADS對(duì)XIAP過(guò)表達(dá)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 2A)，與Vector組比較，Vector+DADS組細(xì)胞遷移距離減少，而XIAP組遷移距離增加(P<0.05)；與XIAP組比較，XIAP+DADS組細(xì)胞遷移距離較XIAP組減少，但高于Vector+DADS組(P<0.05)。

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 2B)，與Vector組比較，Vector+DADS組遷移的細(xì)胞數(shù)量減少，XIAP組遷移的細(xì)胞數(shù)增加；XIAP+DADS組遷移細(xì)胞數(shù)量較XIAP組減少，但高于Vector+DADS組。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)XIAP增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力，而DADS降低XIAP過(guò)表達(dá)細(xì)胞的遷移能力。

2.3 DADS對(duì)XIAP過(guò)表達(dá)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 3)，與Vector組比較，Vector+DADS組細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的數(shù)量減少，XIAP組細(xì)胞數(shù)量增加；DADS處理XIAP過(guò)表達(dá)細(xì)胞后，侵襲細(xì)胞數(shù)比XIAP組少，但XIAP+DADS組侵襲細(xì)胞數(shù)高于Vector+DADS組。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)XIAP增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力，而DADS抑制XIAP過(guò)表達(dá)細(xì)胞的侵襲能力。

2.4 DADS通過(guò)miR-7下調(diào)胃癌細(xì)胞XIAP表達(dá)用30 mg·L-1DADS處理細(xì)胞24 h，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 4A)，DADS上調(diào)SGC7901細(xì)胞miR-7水平(P<0.05)。利用DIANA-microT-CDS、miRBase和Targetscan 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-7的靶基因，結(jié)果均顯示XIAP mRNA 3′ UTR存在miR-7特異性結(jié)合位點(diǎn)(Fig 4B)。

為了研究miR-7對(duì)XIAP 表達(dá)的調(diào)控作用，首先用qRT-PCR驗(yàn)證了miR-7和miR-7-antago載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后分別上調(diào)和下調(diào)miR-7表達(dá)(P<0.01)(Fig 4C)。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 4D)，與Vector比較，過(guò)表達(dá)miR-7抑制XIAP 3′ UTR WT轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性(P<0.01)；而在XIAP 3′ UTR Mut轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Vector與miR-7組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明XIAP 3′ UTR是miR-7的直接作用靶點(diǎn)。接下來(lái)分別觀察miR-7和miR-7-antago對(duì)XIAP表達(dá)的影響，如Fig 4E，F(xiàn)所示，與Vector組比較，過(guò)表達(dá)miR-7下調(diào)XIAP mRNA和蛋白水平，而miR-7-antago上調(diào)XIAP mRNA和蛋白水平(P<0.01)。上述結(jié)果表明，miR-7靶向負(fù)調(diào)控XIAP 表達(dá)，DADS可通過(guò)上調(diào)miR-7抑制XIAP表達(dá)。

Fig 2 DADS inhibited migration of XIAP overexpressed cells

Fig 3 DADS inhibited invasion of XIAP overexpressed cells

Fig 4 DADS decreased XIAP expression through upregulating miR-7

3 討論

DADS通過(guò)多靶點(diǎn)干預(yù)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路、發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究DADS是否通過(guò)下調(diào)XIAP發(fā)揮抗胃癌作用及其負(fù)調(diào)控XIAP的機(jī)制。

XIAP抑制凋亡蛋白caspases可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡抑制和增殖，并且它參與信號(hào)通路調(diào)節(jié)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[1]。β-thujaplicin下調(diào)XIAP可增強(qiáng)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡、抑制增殖[11]。褪黑素通過(guò)下調(diào)XIAP抑制增殖、增強(qiáng)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[12]。XIAP高表達(dá)與胃癌生長(zhǎng)具有相關(guān)性，下調(diào)XIAP可抑制胃癌細(xì)胞增殖[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)XIAP促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，DADS能下調(diào)過(guò)表達(dá)細(xì)胞XIAP、抑制細(xì)胞增殖，說(shuō)明DADS可通過(guò)下調(diào)XIAP抑制胃癌細(xì)胞增殖。XIAP抑制劑embelin干預(yù)PI3K/AKT、JAK/STAT、p38、p53等信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)[13]。我們分析，DADS下調(diào)XIAP可能發(fā)揮與embelin類(lèi)似的干預(yù)信號(hào)通路作用，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖。

XIAP表達(dá)增高與胃癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)[2]；下調(diào)XIAP表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞遷移侵襲[4]，提示XIAP可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移潛能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，XIAP過(guò)表達(dá)細(xì)胞遷移侵襲能力增強(qiáng)，DADS下調(diào)XIAP、抑制過(guò)表達(dá)細(xì)胞遷移侵襲，表明DADS可抑制XIAP介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞遷移侵襲。XIAP介導(dǎo)TGFβ誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞由上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)，使細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移潛能[14]。我們之前報(bào)道，DADS抑制TGFβ誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞EMT[15]。由此推測(cè)，DADS可能通過(guò)干預(yù)TGFβ/XIAP通路抑制EMT、降低胃癌細(xì)胞遷移侵襲能力。

miRNAs通過(guò)結(jié)合mRNA 3′ UTR調(diào)控基因表達(dá)。miR-7在胃癌中發(fā)揮抑癌分子的功能，miR-7低表達(dá)與胃癌臨床進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)，恢復(fù)miR-7表達(dá)可下調(diào)EGFR、NFκB、Raf-1等癌基因表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、降低轉(zhuǎn)移潛能[16-17]。我們通過(guò)miRNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-7在DADS處理的胃癌細(xì)胞中上調(diào)[10]。本研究利用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)到XIAP 3′ UTR存在miR-7結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)明確了XIAP是miR-7的直接作用靶點(diǎn)。過(guò)表達(dá)和敲低miR-7的實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-7在胃癌細(xì)胞靶向負(fù)調(diào)控XIAP表達(dá)。我們分析，miR-7在胃癌中低表達(dá)可能引起XIAP表達(dá)增高，導(dǎo)致后者促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，DADS上調(diào)miR-7，且miR-7負(fù)調(diào)控XIAP表達(dá)，表明miR-7介導(dǎo)DADS下調(diào)胃癌細(xì)胞XIAP表達(dá)，DADS干預(yù)miR-7-XIAP信號(hào)軸可能是其發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移侵襲作用的機(jī)制之一。

綜上，DADS下調(diào)XIAP可抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移侵襲，DADS上調(diào)miR-7可抑制XIAP表達(dá)，從而揭示DADS通過(guò)上調(diào)miR-7下調(diào)XIAP、抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移侵襲。然而，體外研究結(jié)果還需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)佐證。為此，我們后續(xù)將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-7負(fù)調(diào)控XIAP是否介導(dǎo)DADS發(fā)揮體內(nèi)抗胃癌作用。