納米金可視化檢測苯代三聚氰胺

陳娜,甘慶潔,秦茹瑾,張裕平

（河南科技學院化學化工學院,河南 新鄉 453003）

納米金是一種處于亞穩狀態的粒子其粒徑在1.00~100 nm 之間.由于納米金可與生物大分子反應且不影響其生物活性以及獨特的光學特性,在太陽能電池[1]、傳感技術[2-3]、光學成像[4]、生物醫學[5-6]、催化[7]、電子[8]和食品安全檢測[9]等領域廣泛應用.目前,納米金的檢測通常采用分光光度法[10]、電化學法[11]、比色法[12]、熒光法[13]等.

利用納米金檢測樣品已經成為現代檢測的重要手段之一,田欣雨等[14]構建了納米金對尿酸的檢測,得出檢測限為1.00×10-7mol/L,線性方程為y=0.263 2 x+0.891 1,該檢測方法靈敏度高、檢出限低,但該方法相關性較差,r 為0.984 3.張建等[15]利用納米金構建了左旋多巴的檢測方法,得出檢測限為4×10-6mol/L,線性方程為y=2.121 8 x+0.041 6,該檢測方法成本低、樣品用量少,但檢出限高.張萬方等[16]構建了對氨芐青霉素的檢測,得出最低檢測限為1×10-8mol/L,線性方程為y=0.163 6 x+0.02 5,r=0.997 6,該檢測方法靈敏度高,反應快,但所用儀器相對昂貴.

苯代三聚氰胺（2,4- 二氨基-6- 苯基-1,3,5- 三嗪）常作為制取熱固性樹脂、氨基涂料[17]、醫藥及改良樹脂與染料[18]的原材料,也可用作樹脂纖維的助化劑.同時,人們也注意到了其危害性.我國于2016年頒布的GB／T 9685—2016《食品接觸材料及制品用添加劑使用標準》法規明確規定,在食品包裝材料中苯代三聚氰胺的特定遷移量不得超過5.0 mg/kg.在實驗室研究中,對于苯代三聚氰胺的測定多采用高效液相色譜—串聯質譜聯用[19]、毛細管電泳[20]等方法.這些方法雖然靈敏度高、精密度好,但存在所需儀器設備昂貴,不能在非試驗條件下實現快速檢測.因此構建納米金可視化檢測苯代三聚氰胺,在一定程度上可以降低對場地和精密儀器的依賴,降低檢測成本.

本研究基于納米金（AuNPs）的團聚顯色,構建了苯代三聚氰胺的檢測方法.當納米金與苯代三聚氰胺發生相互作用時,AuNPs 發生團聚顯色,使其最大紫外吸收峰發生紅移,由此建立了苯代三聚氰胺的可視化測定方法.大量的檸檬酸覆蓋在納米金（AuNPs）表面,此時納米金表面帶負電,通過靜電作用而穩定存在.苯代三聚氰胺中帶有一個氨基,通過氨基和AuNPs 化學鍵合,促使AuNPs 顆粒間的距離減少,在NaCl 的誘導作用下,使AuNPs 發生明顯的團聚,溶液由紅色變成藍色.該檢測方法結果便于觀察,操作簡單,且不局限于固定的試驗環境,可用于苯代三聚氰胺快速檢測.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

101 型電熱鼓風干燥箱,北京市永光醫療儀器有限公司;TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;SB-5200DT 超聲波清洗機,鄭州生元儀器有限公司;JEM- 2010 透射電子顯微鏡,日本電子株式會社;101-E 真空干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司;HT7700 BT-Zeta100 Zeta 電位/粒度/分子量分析儀,丹東百特儀器有限公司;ME104F 電子天平,上海梅特勒- 托利多儀器有限公司;98-2 數顯恒溫磁力攪拌器,金壇市華峰儀器有限公司.

苯代三聚氰胺（BG）,北京百靈威科技有限公司;氯金酸,國藥集團化學試劑有限公司;無水乙醇,天津市德恩化學試劑有限公司;氯化鈉,天津市大茂化學試劑廠;檸檬酸鈉,北京雙環化學試劑廠.試驗試劑均為分析純,試驗用水為超純水.

1.2 檢測機理

納米金的制備及其可視化檢測苯代三聚氰胺的檢測機理如圖1 所示.

圖1 金納米顆粒制作機理和團聚機理Fig.1 Fabrication mechanism and Agglomeration mechanism of gold nanoparticles

采用檸檬酸鈉作為還原劑,還原氯金酸得到表面帶負電的金納米顆粒（如圖1-a）,再利用金納米顆粒在特定條件下可以與氨基化合物發生顯色反應的特點,使其與苯代三聚氰胺反應,觀察反應現象（如圖1-b）.反應機理如圖1 所示,氯金酸中的金離子與檸檬酸鈉接觸后,還原生成金原子,金原子的數目迅速上升至飽和,并在剩余檸檬酸鈉的保護下與金原子結合形成帶負電的納米金粒子,使得納米金在靜電效應的作用下相互排斥,呈游離狀,分布均勻.在生成的納米金粒子中加入苯代三聚氰胺,游離的納米金顆粒與苯代三聚氰胺上的氨基反應,使其有機地連接起來,從而發生團聚現象,溶液由酒紅色變為藍色.因此可以通過觀察混合溶液體系的顏色變化實現對苯代三聚氰胺的可視化檢測.

1.3 試驗方法

1.3.1 納米金的制備 根據文獻[21]和[22]采用檸檬酸鈉合成法制備AuNPs：500 mL 的棕色瓶中加入30 mg 氯金酸,300 mL 水,在磁力攪拌器上加熱,并在沸騰后迅速加入15 mL 質量為0.15 g 檸檬酸鈉,持續加熱10 min,溶液由淡黃色變為酒紅色,停止加熱,繼續攪拌溶液冷卻至室溫.

1.3.2 AuNPs-NaCl-BG 反應測定 在一系列4 mL 的比色瓶中,加入2 mL 納米金,100 μL濃度為0.1 mol/L NaCl 及一系列濃度（5、10、25、40、60、100、200、300 μmol/L）的苯代三聚氰胺（BG）,靜置5 min,觀察顏色變化.

以不添加目標物的體系為參比,利用TU－1901 雙光束紫外可見分光光度計進行光譜掃描,測定混合溶液在400~800 nm 的紫外吸收光譜.根據不同濃度苯代三聚氰胺吸收情況繪制波長λ 與吸光度的關系圖,計算苯代三聚氰胺濃度與吸光度A630之間的線性關系.

1.3.3 納米金與BG 反應的影響因素（1）NaCl 濃度：配置系列濃度（0、0.067、0.100、0.120、0.130、0.140、0.150 mol/L）的NaCl 溶液,在一系列4 mL 的比色瓶中,加入2 mL 納米金,100 μL 系列濃度的NaCl,1 mL濃度為100 μmol/L 苯代三聚氰胺（BG）,混合均勻,靜置5 min,觀察不同NaCl 濃度反應顯色現象.

（2）pH 值：配制系列（3、4、5、6、7、8）pH 值的納米金溶液,依次滴加0.2 mL系列pH 的納米金,10 μL濃度為0.1 mol/LNaCl,100 μL 系列濃度的苯代三聚氰胺溶液,靜置5 min 觀察溶液顏色變化.

2 結果與討論

2.1 納米金選擇性分析

苯代三聚氰胺選擇性紫外光譜圖如圖2 所示.

圖2 苯代三聚氰胺選擇性紫外光譜圖Fig.2 The UV spectrum of phenylmelamine

分別考察了單一BG、NaCl 對納米金,以及BG 和NaCl 同時存在時對納米金的影響.由圖2 可知,單一的納米金溶液呈酒紅色,單獨加入BG 或NaCl 時,納米金溶液都不發生顏色變化.當BG、NaCl 同時存在時,游離金顆粒與氨基發生反應,聚集產生團聚,顆粒變大,溶液由酒紅色變為藍色.用TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計檢測發現,單獨加入BG 或NaCl 時,溶液的最大吸收峰在520 nm 左右,當同時加入BG、NaCl 時,溶液的最大吸收峰發生紅移至665 nm,表明溶液發生了團聚反應.

2.2 AuNPs 與AuNPs-NaCl-BG 的形貌特征

為了驗證納米金與苯代三聚氰胺的顯色現象是由納米金的團聚反應產生的,利用透射電子顯微鏡和Zeta 電位/粒度/分子量分析儀對AuNPs 與AuNPs-NaCl-BG 的粒徑、微觀形貌進行分析.如圖3 所示.

圖3 納米金與BG 的電鏡分析及粒徑分析Fig.3 The SEMand particle size analysis of AuNPs and BG

從圖3 可知,檸檬酸鈉還原氯金酸制備的納米金溶液尺寸均一,分布均勻（如圖3-a）.當加入NaCl及苯代三聚氰胺反應后,納米金顆粒發生團聚現象,粒徑明顯增大（如圖3-b）.由粒徑分析圖可以看出,游離的納米金粒子粒徑在10 nm 左右,尺寸單一,分布均勻（如圖3-c）.當納米金、NaCl 和苯代三聚氰胺發生反應后（如圖3-d）,可以觀察到游離的納米金粒子發生團聚現象,粒徑明顯變大,約為100 nm.由此表明,苯代三聚氰胺與納米金粒子的顯色反應是由納米金的團聚反應造成.

2.3 AuNPs-NaCl-BG 溶液的線性范圍

在最佳試驗條件下,納米金的顯色現象隨苯代三聚氰胺濃度增大呈梯度變化,如圖4 所示.由酒紅色變為紫色,最后變為藍色.使100 μL 濃度為0.1 mol/L NaCl、2 mL 納米金、100 μL 系列濃度苯代三聚氰胺反應,由圖4 可以看出,當苯代三聚氰胺濃度在0~300 μmoL/L 時,隨苯代三聚氰胺濃度的變大,AuNPs-NaCl-BG 混合溶液吸收光譜在520 nm 處的峰值不斷下降,同時產生紅移,說明該現象與納米金的團聚反應有關.當苯代三聚氰胺濃度高于40 μmoL/L 時,710 nm 處凸起一個新的吸收峰.該現象表明納米金溶液發生了團聚反應,顆粒變大產生了新的吸收峰.

圖4 不同濃度苯代三聚氰胺吸光度與波長的紫外光譜圖Fig.4 UV-vis absorbance of AuNPs upon addition of different concentrations of benzoguanamine.

根據試驗結果繪制不同濃度BG、納米金與NaCl反應后的吸光度關系圖以及苯代三聚氰胺在5~90μmoL/L濃度范圍內的線性關系如圖5 所示.

圖5 630 nm 波長下納米金、NaCl 與不同濃度BG 的關系Fig.5 Relationship between AuNPs,NaCl and different concentrations of BG at 630 nm wavelength

由圖5 可以看出,當苯代三聚氰胺濃度在0~90 μmoL/L 時,溶液的吸光度隨苯代三聚氰胺的濃度增大逐漸變大.當苯代三聚氰胺濃度大于90 μmoL/L 時,溶液的吸光度變化趨于穩定,且隨著苯代三聚氰胺濃度的增大,吸光度不再變化,表明納米金完全發生團聚.同時當苯代三聚氰胺的濃度在0~90 μmoL/L時,溶液的吸光度隨苯代三聚氰胺的濃度呈良好的線性關系,其線性關系為y=0.003 9 x+0.063 5,r=0.994 9、檢測限為6.00 μg/L,故AuNPs-NaCl-BG 混合溶液線性關系良好.

2.4 納米金與BG 反應的影響因素

2.4.1 鹽濃度的影響 鹽作為一種誘導劑,一直是影響納米金團聚反應的重要因素,鹽濃度過低納米金與苯代三聚氰胺不能發生團聚現象,濃度過高會使納米金與苯代三聚氰胺的混合溶液直接發生聚沉.在比色瓶中加入100 μL系列濃度的NaCl,100 μL濃度為100 μmol/L 苯代三聚氰胺,2 mL 納米金,混合均勻,觀察溶液顏色變化.顯色反應如圖6 所示.

圖6 BG 與AuNPs 在不同NaCl 濃度下的顯色反應Fig.6 Color reaction of BG and AuNPs under different NaCl concentrations

由圖6 可知,NaCl 濃度對納米金的顯色反應有著顯著的影響.隨著NaCl 濃度增大,混合溶液的顏色由酒紅色逐漸變為藍色.當鹽濃度低于0.067 mol/L 時,肉眼難以觀察到納米金的顯色現象,當鹽濃度大于0.067 mol/L 時,可以明顯觀察到納米金溶液變為藍色,隨著NaCl 濃度的增大,溶液顏色發生酒紅色-紫色- 藍色的變化,而當鹽濃度大于0.150 mol/L 時,納米金溶液則直接發生聚沉.因此在納米金的顯色反應中,采用NaCl 的最佳濃度為0.100 mol/L.

2.4.2 pH 值的影響 pH 值一直都是化學反應中的重要影響條件,溶液的pH 值對反應的選擇性靈敏度等因素也有著較大的影響.配制一系列pH 值的納米金溶液,并利用比色板進行不同濃度、不同pH 值和不同苯代三聚氰胺濃度的點板,試驗結果如圖7 所示.

圖7 苯代三聚氰胺濃度與pH 值對納米金團聚影響Fig.7 Effect of Benzoguanamine concentration and pH value on gold nanoparticles agglomeration.

由圖7 可知,pH 值的大小對顯色現象有著明顯的影響,當pH 值在3~7 時,隨著pH 值增大,溶液顏色發生藍色- 紫色- 酒紅色的變化,且隨著苯代三聚氰胺濃度的增大,溶液逐漸由酒紅色變為藍色,當pH 值大于7 時,隨苯代三聚氰胺濃度變化,溶液的顯色反應不再明顯.因此納米金的顯色現象隨溶液BG濃度和酸性的增大不斷增強——溶液顏色變化為：酒紅色- 紫色- 藍色.

3 結論

基于氯金酸在檸檬酸鈉的作用下制取納米金（AuNPa）.研究表明,AuNPs 和苯代三聚氰胺在NaCl 的誘導作用下發生反應,溶液會從酒紅色變成藍色,且隨苯代三聚氰胺、NaCl 濃度升高、酸性變強,溶液顏色越接近藍色.在最佳的pH 和NaCl 濃度下,該方法對苯代三聚氰胺檢測的檢測限為6.00 μg/L,線性方程為y =0.003 9 x+0.063 5,相關系數r=0.994 9.該測定方法分析簡單、靈敏度高、耗時短、成本低.