緩釋雙氯芬酸鈉的透明質酸可溶性微針的制備與表征*

陳可欣，尚少梅

(北京大學 護理學院，北京 100191)

透皮給藥是一種安全快捷的給藥方式，但傳統透皮給藥方式效率低下。微針作為一種新型透皮給藥的方式，通過在皮膚中形成微米級別的通道來突破皮膚屏障，從而將藥物高效地遞送至體內發揮藥效，大大地提升給藥效率。除此之外，微針還具有無痛、無創、方便給藥、減少尖銳醫療廢物產生等其他給藥方式不具備的優點。根據功能不同，微針可大致分為5種類型，分別是實心微針、涂層微針、水凝膠微針、空心微針和可溶微針[1]。其中，可溶微針是由可生物降解的水溶性聚合物制作而成的微米長針陣列，常用于制作微針的可溶性聚合物有聚乙烯醇、右旋糖酐、殼聚糖、海藻酸鈉、聚乳酸、透明質酸等[2]。可溶微針與其他幾種微針相比，生物相容性好，藥物的釋放速率也可以通過改變微針的載體材料而調節，是目前研究的熱點[3]。透明質酸是人體內源性物質，具有良好的生物相容性。以透明質酸為基質制備的微針力學性能好，可生物降解，成本低廉[4-5]。透明質酸中可加入相應藥物制備成微針進行給藥，但藥物會釋放過快，增加給藥次數，降低患者的順應性，難以維持有效的血藥濃度，無法保證藥物的治療效果。基于此，筆者應用了一種可緩釋藥物的納米材料b-MSNs。

在不同類型的納米載藥材料中，b-MSNs因其具有良好的生物相容性以及穩定性而受到越來越多的關注[6]。它可以調節藥物釋放的速度，提高藥物治療的安全性以及高效性。b-MSNs表面易修飾與功能化，其孔中可以有效地裝載各類藥物。且b-MSNs可降解，不會滯留在身體造成免疫反應[7]。DS是臨床中常用的一類非甾體類抗炎藥，可以治療風濕性關節炎、紅斑狼瘡、各種手術引起的疼痛及各種原因引起的發熱。口服DS最常見的不良反應是胃腸道反應[8]。通過微針遞送雙氯芬酸鈉可以大大減少不良反應的發生。本文中，將DS包封至b-MSNs后，與HA結合制成可溶微針，探究b-MSNs的表征、生物相容性、藥物緩釋以及微針的制備工藝、表征、力學性能的參數，該微針可在保持良好生物相容性以及力學性能的同時緩釋藥物，長時間維持有效的藥物濃度。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

材料包括：透明質酸(hyaluronic acid，HA，天津希恩思生化科技有限公司)、雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium，DS，北京百靈威科技有限公司)、聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)、十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyl trimethyl ammonium chloride，CTAC，北京百靈威科技有限公司)、SD大鼠(斯貝福生物技術有限公司)、PRMI 1640細胞培養基(北京索萊寶科技有限公司)、Alpha MEM培養基(北京索萊寶科技有限公司)、青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)、特級胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS，北京翱擎生物科技有限公司)、脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS，SIGMA公司)、ELISA試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)、CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)和三乙醇胺(Triethanolamine，TEA，北京百靈威科技有限公司)。

設備包括：微針模具(蘇州永沁泉智能設備有限公司)、離心機(SIGMA公司)、數字測力儀(OMEGA公司)、透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope，TEM，徠卡顯微系統貿易有限公司)、NanoDrop微量分光光度計和熒光分光光度計(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 b-MSNs-DS的合成步驟

將120 mL CTAC(25wt%)、0.9 g TEA和180 mL水在60 ℃條件下連續攪拌1 h。將混合溶液(5 mL TEOS和95 mL環己烷)緩慢添加到水溶液中，形成水相和有機相分層的環境。低速攪拌60 h。通過高速離心收集水相中含有CTAC的b-MSNs。將其在60 ℃的酸性甲醇溶液中均勻分散1天，以除去CTAC模板，得到b-MSNs[9]。將180 mg b-MSN、30 mg DS、30 mL PBS超聲分散均勻，黑暗條件下攪拌24 h，離心分離可得b-MSNs-DS。

1.3 透明質酸微針的制作方法

6 mL去離子水中加入6 mg的b-MSN-DS，超聲分散均勻，配置成b-MSN-DS溶液，稱取2 g HA，分3次加入b-MSN-DS溶液中并使用渦旋震蕩儀進行渦旋，靜置于4 ℃冰箱中24 h，得到膠狀的微針針尖溶液。用上述方法將2 g HA加入6 mL去離子水中，得到膠狀的微針基底溶液。取微針針尖溶液置于PDMS微針模具中，以5 500 r/min的轉速離心15 min，使微針針尖溶液完全進入微針模具的針尖部分，小心刮除微針基底部的微針針尖溶液，將微針基底溶液置入PDMS微針模具中，以5 500 r/min的轉速離心10 min，去除溶液中氣泡制備出b-MSN-DS透明質酸微針。使用相同的工藝制備含有等量藥物的DS透明質酸微針。制備微針的具體工藝如圖1所示。

1.4 試驗方法

將微針以5 N的力按壓在數層封口膜上1 min，計數每層封口膜的針孔個數。使用數字測力儀計算微針的受力，將微針基底部固定，針尖朝上，逐漸增加力的強度并記錄針尖位移，制作力-位移曲線圖，以評估微針的機械強度。使用MC3T3-E1細胞，通過CCK-8法測試b-MSN的生物相容性。將細胞以30×103個/孔的密度接種在96孔板中，使用含有10%胎牛血清的Alpha MEM培養基培養24 h，之后與不同濃度的b-MSN培養1天、3天、5天，最后加入100 μL/孔的CCK-8工作液共同孵育2 h，使用酶標儀在450 nm處記錄吸光度，將所得數值與控制組進行對比得出細胞活性，每組設定3個復孔。將巨噬細胞以10×103個/mL的密度鋪于6孔板中，24 h后吸走原有培養基，加入含有5 μg/mL LPS的培養基刺激巨噬細胞活化，8 h后加入b-MSN、b-MSN-DS、DS，使用ELISA試劑盒，按照試劑盒說明書的步驟測試每組的抗炎效果。使用PBS配置0.01～0.05 mg/mL的雙氯芬酸鈉溶液，使用微量分光光度計測試DS溶液的吸光度。選取276 nm處的數據進行計算，得到DS溶液的吸收-濃度標準曲線。為驗證b-MSN-DS透明質酸微針的緩釋效果，將制備好的載藥材料與2 mL PBS置于透析袋內密封于透析袋中，將透析袋置入98 mL的PBS中，在37 ℃條件下置于搖床中恒溫震蕩，用來模擬體外藥物釋放。用微量分光光度計測定樣品不同時間點的樣品的吸光度，根據標準曲線測定藥物含量并繪制釋藥曲線。為檢測b-MSN-DS透明質酸微針有無刺入皮膚，進行離體皮膚刺入試驗，具體試驗步驟為：將大鼠麻醉后，用剃毛器除去背部毛發，使用外科手術刀取下大鼠背部完整的全層皮膚。除去多余的皮下組織后用異丙醇擦拭皮膚的真皮側，去除粘附在皮下的殘留脂肪。隨后，使用PBS反復清洗皮膚，之后用紗布擦干。將微針以5 N的力按壓在取下的大鼠皮膚上5 min后放置在固定液中進行脫水包埋，將包埋好的皮膚組織進行切片，切片的厚度為5 μm。將切好的皮膚組織進行脫蠟后再進行蘇木素-伊紅染色(HE染色)。

2 結果與討論

2.1 b-MSN及b-MSN-DS表征

通過TEM對b-MSN及b-MSN-DS進行了表征，透射電子顯微鏡圖片如圖2所示。圖2a中顯示b-MSN呈均勻的球形，具有有序的介孔結構；圖2b顯示b-MSN負載DS后，納米粒子的形態變化不大，這是由于藥物進入介孔，沒有影響b-MSN的球形結構。

2.2 微針表征

所制備的微針陣列為直徑17.5 mm的圓形，每片微針針尖個數為358，針尖距離為700 μm，針尖高度為500 μm。微針的表征如圖3所示，圖3a為微距攝像機下的b-MSN-DS透明質酸微針；圖3b為掃描電子顯微鏡下的微針針尖，掃描電子顯微鏡下顯示微針針尖分布均勻；圖3c為掃描電子顯微鏡下的單個微針針尖，針尖呈錐形。微針的表征顯示微針充分填滿了PDMS微針模具，形成針尖尖銳、分布均勻的微針。

2.3 微針機械強度測試

純透明質酸微針和b-MSN透明質酸微針的力-位移曲線(見圖4a)變化不大，且刺破前三層封口膜的針尖個數一致(見圖4b)，說明b-MSN對微針的機械強度影響不大。力-位移曲線圖顯示，隨著施加的力逐漸增大，直到單個針尖受力為0.25 N之前，微針的位移變化不大，說明微針針尖未被破壞。該微針針尖個數為358，共能承受89.5 N的力。相關文獻顯示單個微針針尖刺破皮膚所需的力大于0.058 N即可[10]。所以該微針完全可以刺破皮膚。

2.4 生物相容性試驗

透明質酸是通過美國食品藥監局審核的一種安全的材料，有多種臨床用途，可以保水、潤滑、促進修復等。DS也是臨床上常用的解熱鎮痛藥物，其用藥量與安全性已經過相關檢驗。所以筆者檢測了b-MSN的生物相容性(見圖5)，經過CCK-8檢測，不同濃度梯度的b-MSN與MC3T3-E1細胞孵育24 h后與未加b-MSN的對照組相比，細胞活性均在85%以上，b-MSN與細胞孵育1天、3天、5天后，細胞活性也沒有明顯的下降。說明b-MSN材料安全性高，對細胞生長沒有明顯的影響。

2.5 抗炎試驗

LPS可以刺激巨噬細胞產生炎癥因子，如IL-1β、IL-6，導致組織產生炎癥反應[11]。DS可以通過調節IL-1β、IL-6的表達來抑制炎癥。將b-MSN、b-MSN-DS、DS和LPS誘導活化的巨噬細胞共同孵育，使用ELISA試劑盒測定每組巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6的多少，每組重復3次。b-MSN抗炎效果如圖6所示，圖6顯示LPS刺激后，IL-1β、IL-6分泌明顯增加，b-MSN-DS組和DS組有抑制炎癥的效果且b-MSN-DS組效果更明顯，這可能是b-MSN-DS具有緩釋作用使抗炎效果更佳。

2.6 體外藥物釋放試驗

經計算b-MSN-DS的載藥率為3.8%。b-MSN-DS透明質酸微針釋藥曲線(見圖7)顯示，藥物在10 h內快速釋放，隨后進入相對穩定的階段，在70 h后藥物釋放量才幾乎沒有變化。DS透明質酸微針在5 h幾乎就釋放完全部的藥物。b-MSN-DS透明質酸微針可以達到緩釋藥物的效果，進而提高治療效果，降低給藥頻率。

2.7 離體皮膚刺入試驗

皮膚組織縱向切片后進行HE染色(見圖8)，顯微鏡下可觀察到皮膚的表皮層、真皮層和皮下組織。以5 N的力刺入皮膚5 min后，刺破角質層，形成微通道。藥物可經該通道進入皮下，發揮藥效。

3 結語

本文基于可溶性微針技術制備了緩釋雙氯芬酸鈉的透明質酸可溶性微針，并對微針內部的載藥材料b-MSNs-DS的表征以及微針的制備工藝、表征、生物相容性、抗炎效果、藥物緩釋效果、力學性能進行評價。b-MSNs-DS透明質酸微針可以緩釋藥物，從而較長時間內保持有效的藥物濃度，解決了藥物釋放過快的問題。在臨床醫學中有廣泛的應用前景。