網絡藥理學結合體內實驗探討肺康顆粒對慢性阻塞性肺疾病大鼠Hippo信號通路核心分子MST1/2的影響

馮浠鐮，張偉，劉小虹，楊柳柳

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，廣東廣州 510405）

全球慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）倡議（GOLD）的最新更新將COPD的概念定義為一種常見的、可預防和可治療的疾病，其特征為持續性呼吸道癥狀和氣流受限[1 s內呼氣量（FEV1）＜80%預計值，FEV1/用力肺活量（FVC）＜70%]，通常是由于長期暴露于有害顆粒或煙霧、引起氣道和/或肺泡異常所致[1-2]。COPD是導致全世界死亡率上升的主要原因，并且在不斷增加[3-5]。COPD西醫藥物療法主要包括吸入性支氣管擴張藥（如β2-激動劑、抗膽堿能藥等）和糖皮質激素，這些藥物已被證明可有效緩解癥狀并降低加重風險；然而，COPD的治療仍然具有挑戰性，因為，COPD患者的癥狀和氣道炎癥會持續存在[6-7]，盡管積極地應用藥物維持治療，某些患者的病情仍繼續加重、持續惡化[8]。

中醫藥因可靠的治療效果和較少的副作用為系統性預防和治療COPD等復雜疾病提供了廣闊的前景[9-11]。肺康顆粒以“培土生金”為成方思想，由五指毛桃、太子參、白術、炒紫蘇子、茯苓、北杏仁等組成，具有補脾益肺兼以化痰止咳的功效，本課題組前期臨床研究表明，其可有效治療COPD。另外，本課題組前期通過網絡藥理學結合生物信息學的方法，探究了肺康顆粒的治療成方、作用靶點及相關信號通路[12]，發現肺康顆粒可能通過Toll樣受體4（TLR4）/核因子kappaB（NFκB）信號轉導通路干預炎癥基因的表達，減輕COPD大鼠的炎癥反應[13]。在此基礎上，本研究再應用網絡藥理學方法預測肺康顆粒治療COPD的關鍵通路，并構建COPD大鼠模型進行體內實驗加以驗證，以期為肺康顆粒臨床應用治療COPD提供研究基礎，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物取70只12周齡的SPF級雄性大鼠，體質量220~240 g，購自廣東省實驗動物中心，動物質量合格證號：SCXK（粵）2018-0002。實驗于廣州中醫藥大學第一附屬醫院普通動物房進行。

1.2 藥物肺康顆粒由五指毛桃30 g、太子參20 g、白術15 g、炒紫蘇子10 g、茯苓15 g、北杏仁10 g組成，中藥材來源于康美藥業。地塞米松注射液（山東辰欣藥業股份有限公司生產，批號：H37021969）。

1.3 試劑與儀器XMU-MP-1[哺乳動物不育系20樣激酶（MST）抑制劑，美國APExBIO生物科技有限公司]；蘇木素-伊紅（HE）染液套裝、RNA提取液、Servicebio?RT第一鏈cDNA合成試劑盒、2×SYBR Green qPCR預混液和引物合成（武漢賽維爾生物科技有限公司）。七匹狼香煙，購于福建龍巖煙草工業有限責任公司。病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；臺式高速冷凍型微量離心機（大龍興創實驗儀器有限公司）；熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司）；超微量分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司）；正置光學顯微鏡、成像系統（日本尼康公司）。

1.4 分組、造模及給藥將70只大鼠隨機分為7組，分別為正常組，模型組，肺康顆粒低、中、高劑量組，MST抑制劑組和地塞米松組，每組各10只。除正常組外，其余大鼠采用單純煙熏法構建COPD模型[14]。造模方法：使用七匹狼香煙，每次10根，每次煙熏1 h，每天2次，大鼠間隔休息時間15 min，連續24周。

肺康顆粒組的大鼠等效劑量按60 kg體質量成人給藥劑量（1.617 g/kg生藥量）折算，低、中、高劑量分別等效于臨床擬用劑量的1、2、4倍[13]。從造模第5周開始用藥：肺康顆粒低、中、高劑量組分別給予肺康顆粒10.11、20.22、40.44 g/kg（以生藥量計）灌胃；地塞米松組給予地塞米松1.0 mg/kg腹腔注射；MST抑制劑組給予XMU-MP-1（5%DMSO溶解）1.0 mg/kg腹腔注射；模型組和正常組給予0.9%生理鹽水2.5 mL灌胃。每天1次，連續灌胃20周。

1.5 肺康顆粒-COPD交集靶點京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析通過傳統中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）獲取中藥成分和靶點，在GeneCards以及OMIM等網站上檢索COPD的相關靶點，應用Bioconductor（https://www.bioconductor.org/）獲取最新安裝包，通過R語言運算得到肺康顆粒成分靶點-COPD交集靶點，將交集靶點進行KEGG分析，并導出相關信號通路，以P＜0.05為差異有統計學意義。

1.6 熒光定量PCR法檢測肺組織TLR4、核因子kappaB抑制蛋白（IκB）、MST1/2、Rac1 mRNA表達取肺組織用1 mL RNA提取液提取總RNA，用Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度。配制如下反應體系，2×qPCR Mix 7.5μL、2.5μmol/L基因引物1.5μL、反轉錄產物2.0μL、ddH2O 4.0μL，進行定量PCR。結果用ΔΔCT法處理。TLR4上游引物序列為5’-GCCATCATTATGAGTGCCAATT-3’，下游引物序列為5’-AGGGATAAGAACGCTGAGAAT T-3’，擴增片段為149 bp；IκB上游引物序列為5’-CTTAGTCTTTGGCTACGTCACT-3’，下游引物序列為5’-CTAGGTCATTCTGCAGGTCAAG-3’，擴增片段為176 bp；MST1/2上游引物序列為5’-ACCC GTGTCGATATTAAGAGAC-3’，下游引物序列為5’-GCTCATCTTCATCCGAGTTTTC-3’，擴增片段為201 bp；Rac1上游引物序列為5’-CCACTGTCC CAATACTCCTATC-3’，下游引物為5’-CTTCTTC TCCTTCAGCTTCTCA-3’，擴增片段為159 bp；GAPDH上游引物序列為5’-ACGGGAAGCTCACT GGCATGGCCTT-3’，下游引物為5’-CATGAGGT CCACCACCCTGTTGCTG-3’，擴增片段為164 bp。

1.7 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察肺組織病理形態將肺組織進行石蠟切片并脫蠟：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-75%酒精5 min，自來水洗；蘇木素染色：切片入蘇木素染液染3~5 min，自來水洗，分化液分化，自來水洗，返藍液返藍，流水沖洗；伊紅染色：切片依次放入85%、95%的梯度酒精脫水各5 min，放入伊紅染液中染色5 min；脫水封片：切片依次放入無水乙醇I 5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-無水乙醇Ⅲ5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min透明，中性樹膠封片；顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.8 統計方法采用R語言進行KEGG通路分析。熒光定量PCR結果以均數±標準差（±s）表示，采用STATA 15.0/C統計軟件進行數據分析，多組比較采用單因素方差分析，并用GraphPad作圖。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 KEGG通路分析結果利用R語言運算，對肺康顆粒-COPD交集基因靶點進行KEGG富集分析，導出相關信號通路相關通路，如表1所示。研究[15]表明，樹突狀細胞與巨噬細胞屬于抗原提呈細胞，其中巨噬細胞在肺內具有清除病原體、參與組織修復作用，而COPD存在反復感染風險和肺組織結構的破壞。由于Hippo通路對巨噬細胞和樹突狀細胞具有調控作用，為研究其對COPD大鼠肺泡巨噬細胞的調節情況，故選擇該通路（P＜0.05，靶基因數目5個）。

表1 肺康顆粒治療慢性阻塞性肺疾病的KEGG通路分析結果Table 1 KEGG pathway analysis results on chronic obstructive pulmonary disease treated by Feikang Granules

2.2 各組大鼠肺組織TLR4、IκB、MST1/2、Rac1 mRNA表達比較圖1結果顯示：與正常組比較，模型組和MST抑制劑組大鼠肺組織TLR4 mRNA表達水平下降（P＜0.05）；與模型組比較，MST抑制劑組TLR4 mRNA表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組及MST抑制劑組比較，肺康顆粒低、中、高劑量組和地塞米松組TLR4 mRNA表達升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），其中，肺康顆粒高劑量組與地塞米松組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠肺組織TLR4、IκB、MST1/2、Rac1 mRNA表達比較Figure 1 Comparison of mRNA expression of TLR4，IκB，MST1/2 and Rac1 in lung tissues among various groups of rats

與正常組比較，模型組和MST抑制劑組大鼠肺組織IκB mRNA表達水平下降（P＜0.05）；與模型組比較，MST抑制劑組大鼠肺組織IκB mRNA表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組和MST抑制劑組比較，肺康顆粒低、中、高劑量組和地塞米松組IκB mRNA表達水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），其中，肺康顆粒高劑量組與地塞米松組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

與正常組比較，模型組和MST抑制劑組大鼠肺組織MST1/2 mRNA表達水平下降（P＜0.05）；與模型組比較，MST抑制劑組和地塞米松組大鼠肺組織MST1/2 mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與模型組和MST抑制劑組比較，肺康顆粒低、中、高劑量組MST1/2 mRNA表達水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

與正常組比較，模型組和MST抑制劑組大鼠肺組織Rac1 mRNA表達水平下降（P＜0.05）；與模型組比較，MST抑制劑組大鼠肺組織Rac1 mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與模型組和MST抑制劑組比較，肺康顆粒低、中、高劑量組Rac1 mRNA表達水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），而地塞米松組Rac1 mRNA表達水平降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

結果表明，應用肺康顆粒及地塞米松后可提升COPD大鼠及使用MST抑制劑的大鼠肺組織下降的TLR4、IκB、MST1/2、Rac1的RNA轉錄。

2.3 各組大鼠肺組織病理變化比較圖2結果顯示，正常組大鼠肺組織肺泡結構完整，炎癥細胞數目浸潤少，模型組和MST抑制劑組大鼠肺泡壁變薄、肺泡結構破壞，而肺康顆粒組和地塞米松組大鼠肺組織結構較模型組和MST抑制劑組有不同程度的恢復。

圖2 各組大鼠肺組織病理變化比較（HE染色，×400）Figure 2 Comparison of histopathologicalchanges in the lung tissues among various groups of rats（HE staining，×400）

3 討論

慢性阻塞性肺疾病（COPD）可歸屬于中醫學“肺脹”的范疇。本虛標實是本病的主要病機，本虛以氣虛為先，而后可發展為陽虛，標實為痰濁、瘀血。肺康顆粒則適用于氣虛兼有痰濁之證，多應用于COPD早期患者。肺康顆粒取培土生金的組方思想，具有益氣健脾、化痰止咳的功效，其中：五指毛桃、太子參補益脾氣以健肺氣，白術、茯苓健脾除濕以減少生痰之源，紫蘇子、杏仁降逆肺氣以止咳平喘。中藥復方是一種多組分多靶點的藥物組成，可通過調節體內分子網絡的活性組分來實現其特定的治療功效。隨著生物信息學、系統生物學和多元藥理學的飛速發展，網絡藥理學已被證明是探索中藥配伍和機理的有效方法[9，16]。本研究借助網絡藥理學分子對接KEGG富集分析的方法，從理論上導出Hippo信號通路，并通過實驗觀察肺康顆粒通過Hippo信號通路核心分子MST1/2對COPD大鼠的免疫調節及組織修復作用。

Hippo信號通路最初由Yu、Zhang等[17-18]在果蠅中發現。哺乳動物中典型的Hippo途徑的核心成分由哺乳動物STE20樣蛋白激酶MST1/2及其銜接蛋白、Sav家族中含WW域的蛋白（WW45）、Mps的一種結合劑1A/B（MOB1A/B）、Yes-相關蛋白（YAP）等組成。MST包括MST1（STK4）、MST2（STK3）、MST3和MST4，屬于生發中心激酶（GCK）家族，MST1和MST2中78%的氨基酸是同源的[19]。MST1分布于細胞質中，結構高度保守，它是一種由487個氨基酸組成的絲氨酸和蘇氨酸激酶，分子量約為55.7 kDa，總長度約113 kb，位于人體細胞的20q11染色體上[20]。在人類中，MST1包含一個激酶區和一個調節區，調節區位于C端，其包含2個功能域[21]。MST1/2激活主要通過2個途徑，一是Caspase介導的裂解可以在C末端切割2個功能域以激活MST1/2，二是通過自身磷酸化，MST1/2在細胞凋亡或應激刺激下多個位點被磷酸化，其中，Thr183和Thr187是MST1/2激活所必需的[22]。

Hippo信號通路對固有免疫具有調節作用。Hippo信號通路通過區分自身和非自身成分發揮固有免疫，而固有免疫系統構成了抵抗微生物感染的第一條關鍵線。吞噬細胞，如嗜中性粒細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞（DC），可以利用模式識別受體來檢測、吞噬，并殺死細胞外病原體[15]。Hippo信號通路分子MST1/2在COPD中巨噬細胞的極化，參與肺組織損傷和修復，可吞噬清除病原微生物和凋亡細胞[23-24]。活性氧是吞噬細胞發揮吞噬和殺滅作用的主要介質，MST1/2通過信號級聯反應，促進活性氧產生和細菌清除[25]。當吞噬細胞MST1/2缺失時，出現明顯的促炎表型，病原體的吞噬作用降低[19]。

Hippo信號通路對適應性免疫應答同樣具有調節作用。最初的體外研究表明，MST1/RAPL復合物在T細胞受體或趨化因子刺激后，對活化、介導T細胞的粘附和遷移發揮重要作用[26]。另外，Zhao等[27]進行的體內動物研究發現，功能喪失的MST突變導致Hippo信號通路組件在調節適應性免疫應答中受到影響。1項針對人類聯合免疫缺陷病兩個家系的4名患者的研究表明，患者外周血循環中的幼稚T細胞數量顯著減少，T細胞的體外活力顯著受損，而這些患者帶有MST的突變[19]。因此，Hippo通路的重要調節因子激酶MST1/2的免疫調節作用意義深遠。

本研究結果顯示，COPD大鼠呈MST1/2低表達狀態，Hippo信號通路可能被抑制，故推測肺組織修復、免疫調節能力下降，是肺泡結構破壞中的一個重要因素。肺康顆粒干預可提高肺組織MST1/2表達，通過Hippo信號通路增強細胞增殖和存活，增強組織修復能力，改善細胞免疫，減輕COPD大鼠肺組織損傷。

本研究同時測定了肺組織中TLR4、IκB、Rac1的轉錄情況，結果顯示：相對于MST抑制劑組和模型組，肺康顆粒低、中、高劑量組TLR4、IκB、Rac1的轉錄水平均升高（P＜0.05）；在TLR4、IκB轉錄情況方面，肺康顆粒高劑量組與地塞米松組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而在Rac1轉錄情況方面，肺康顆粒高劑量組較地塞米松組上調（P＜0.05）；隨著劑量的增加，肺康顆粒低、中、高劑量組TLR4、IκB、Rac1轉錄水平逐漸上調（P＜0.05）。

TLR4是Toll樣受體模式的識別受體，可檢測入侵的微生物和非微生物內源性分子，由巨噬細胞表達[28]，我們推測肺康顆粒通過Hippo信號通路調控免疫時，增加了TLR4的轉錄。IκB是NF-κB信號通路上的抑制蛋白，NF-κB通路的抑制可降低異常炎癥反應，因此，有研究應用NF-κB通路的抑制劑來治療哮喘及COPD[29]，而Hippo信號通路下游的YAP可直接調節IκB轉錄[30]，故我們推測肺康顆粒通過增加IκB轉錄進而抑制NF-κB通路來治療COPD。有研究顯示TLR4信號通過機械傳感器Piezo1蛋白增強巨噬細胞的殺菌活性，是因為激活了巨噬細胞CaMKII-MST1/2-Rac軸以進行病原體攝取和殺死，敲除MST1/2或Rac1會導致巨噬細胞殺菌活性降低[31]，故我們推測肺康顆粒通過促進MST1/2和Rac1轉錄，發揮巨噬細胞調節作用。

綜上所述，肺康顆粒可通過調控COPD大鼠肺組織Hippo信號通路中MST1/2的表達，發揮免疫調節及組織損傷修復作用。