益母草顆粒對大鼠產后子宮復舊不全的恢復作用

張軍，阮慧，劉濤，馬麗

（武漢市第七醫院，湖北武漢 430071）

妊娠期子宮會發生一定程度的改變直到分娩后子宮開始重塑恢復[1]。產后子宮復舊不全是指產后6周子宮仍未恢復到非孕狀態，即子宮體肌纖維不能如期縮復和子宮內膜再生障礙，主要表現為產后腹痛、血性惡露持續淋漓不凈，或反復間歇性血性惡露，并可在此基礎上繼發盆腔感染、月經失調、貧血、不孕等，直接危害婦女的身心健康。其誘發原因復雜，多與盆腔感染及胎膜殘留有關[2]。臨床醫學對于產后子宮復舊患者的治療方法多為對癥宮縮劑及物理療法，但是依從性較差[3]。中醫藥對產后子宮復舊不全顯示出了良好的治療作用，并且具有安全性、依從性較高的特點。根據產后復舊不全的臨床表現，其歸屬于中醫學“產后惡露不絕”的范疇。中成藥益母草顆粒具有活血調經的功效，主治血瘀所致的月經不調、產后惡露不絕，癥見痛經、惡露不盡及月經失調，產后子宮復舊不全見上述證候者，臨床療效良好[4-5]；但其作用機制尚不完全明確。因此，本研究通過建立產后子宮復舊不全大鼠模型，觀察益母草顆粒的子宮修復作用及機制，以期為產后子宮復舊不全患者提供用藥指導。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠（雌性40只，雄性20只），鼠齡均10周，體質量（210±25）g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（桂）2019-0009。本實驗在廣西醫科大學實驗動物中心進行，按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。大鼠飼養于動物房內，常溫，濕度為55%左右，模擬動物的生物周期黑白交替（12 h/12 h），無菌飲食適應性喂養2周。實驗期間均自由飲水及攝食。

1.2 細菌、主要試劑與儀器大腸桿菌（X25922）（青島海博生物公司）。腫瘤壞死因子（TNF）-α、轉化生子因子（TGF）-β1酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海撫生實業有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京達科為生物技術股份有限公司）；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）介導的核苷酸（dUTP）缺口末端標記法（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒[弗元（上海）生物科技有限公司]；免疫組織化學SP試劑盒（廣州鼎國生物公司）；環氧化酶（COX）-2單抗（美國開曼公司）；TGF-β1單抗[圣克魯斯生物技術（上海）有限公司]；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（上海遠慕生物科技有限公司）。光學顯微鏡（寧波永新光學股份有限公司）；蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.3 藥物及制備益母草顆粒，15 g/袋，由廣西天天樂藥業有限公司生產，生產批號：國藥準字Z45020208。實驗時大鼠用藥量按人與大鼠體表面積比值換算法求得大鼠給藥中劑量為0.043 g/kg，將該藥加入蒸餾水，配制成混懸液備用。桃紅四物湯（由桃仁、當歸、白芍各9 g，紅花、川芎各6 g，熟地黃12 g組成），中藥飲片購自安徽省合肥樂家老鋪中藥飲片有限公司，先將藥材用10倍量的水浸泡1 h，然后常規煎煮2次，每次1 h，最后濃縮至180 g/L。

1.4 分組、造模與給藥將大鼠分為4組，即正常組、模型組、益母草顆粒組及桃紅四物湯組，每組10只。所有大鼠均進行妊娠后自然分娩，除正常組外均采用大腸桿菌（X25922）建立子宮復舊不全模型。造模方法[6]：將雌性大鼠和雄性大鼠按照2∶1比例合籠，次日清晨觀察陰栓并進行陰道檢測，在陰道栓發現精子為妊娠首日。將所有妊娠大鼠在相同環境下進行單籠飼養，直到分娩后第1天。將大腸桿菌用Nacl溶液稀釋1×107/mL，0.2 mL接種于子宮內，注射后第2天均處死1只大鼠，進行子宮切片HE染色觀察，發現大量炎性細胞浸潤，子宮復舊不良，則表示造模成功。造模成功后，益母草顆粒組給予4.3 g/kg益母草顆粒混懸液灌胃，桃紅四物湯組給予4.5 g/kg桃紅四物湯灌胃，模型組和正常組大鼠均灌胃等體積的0.9%生理鹽水，均連續給藥7 d，早晚各1次。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量 末次灌胃后，采集大鼠尾部靜脈血3 mL（每次抽取1 mL，抽取3次），放入離心管中，3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，保留上清液。實驗步驟嚴格按ELISA試劑盒說明書進行操作，依次進行繪制樣本布局表、配制試劑標準品、清洗孔板、加樣、覆膜、洗版、加顯色劑終止液處理。實驗完成后立即用酶標儀在450 nm波長相對630 nm波長處，測定每孔吸光度，繪制標準曲線，然后根據標準曲線，計算TNF-α、TGF-β1濃度。

1.5.2 組織提取及HE染色法觀察大鼠子宮組織病理形態 用1%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，摘取子宮，沖洗污血，一部分放入液氮保存備用，一部分放入10%甲醛溶液中固定過夜，脫水后石蠟包埋制4μm切片。將石臘切片用二甲苯脫蠟后按照100%-95%-85%-75%乙醇進行逐層脫水，蘇木素染色10 min，1%鹽酸處理，伊紅復染，100%-95%-85%-75%乙醇脫水，封片后顯微鏡下觀察子宮組織病理形態變化。

1.5.3 TUNEL法觀察大鼠子宮內膜細胞凋亡情況 將子宮組織切片與蛋白酶K室溫孵育后，浸入TUNEL反應液中。PBS沖洗3次。再用過氧化氫沖洗淬滅酶活性后，聯合抗生物蛋白過氧化氫酶和二氨基聯苯胺覆蓋，光學高倍顯微鏡下觀察凋亡細胞核呈現棕黃色，隨機選擇5個視野，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.5.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1蛋白表達 子宮組織預冷，放射免疫沉淀法（RIPA）裂解提取總蛋白，蛋白定量后上樣，進行1.5%的十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），半干轉至PVDF膜上，5%牛血清封閉，分別加入一抗COX-2（1∶1 000稀釋）、TGF-β1（1∶3 000稀釋）4℃孵育過夜，加入羊抗兔IgG二抗（1∶5 000稀釋）孵育，電化學發光試劑（ECL）顯色曝光。應用ImageJ軟件分析得出目的蛋白的相對表達水平，內參為GAPDH。

1.5.5 免疫組織化學法檢測大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1蛋白表達 子宮組織石蠟切片常規脫蠟后，水化，37.5℃靜置0.5 h后，加入EDTA液抗原修復，山羊血清封閉。加入一抗COX-2及TGF-β1（1∶500稀釋），加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（1∶2 000稀釋）孵育0.5 h后，復染，脫水，透明，封片。顯微鏡下選擇不交叉的10個視野，COX-2在細胞核中呈現棕黃色陽性表達，TGF-β1在細胞漿中呈現棕黃色陽性表達，計算COX-2、TGF-β1陽性細胞數。

1.6 統計方法采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用方差分析，事后檢驗采用Bonferroni法進行組間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平比較表1結果顯示：模型組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平高于正常組（P＜0.05）；益母草顆粒組和桃紅四物湯組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平低于模型組（P＜0.05）；益母草顆粒組血清TNF-α、TGF-β1水平與桃紅四物湯組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平比較Table 1 Comparison of serum TNF-αand TGF-β1 levels among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平比較Table 1 Comparison of serum TNF-αand TGF-β1 levels among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組益母草顆粒組桃紅四物湯組F值P值鼠數/只9 9 9 9 TNF-α/（pg·mL-1）21.33±10.25 56.08±5.11①44.60±6.70①②45.63±7.04①②34.330＜0.001 TGF-β1/（mg·mL-1）852.08±56.06 1 855.32±169.17①1 247.22±77.00①②1 248.39±98.08①②130.500＜0.001

2.2 各組大鼠子宮組織病理形態比較圖1結果顯示：正常組子宮腔形態正常，子宮內膜較厚，肌細胞排列整齊；模型組子宮腔形態異常，子宮內膜較薄，肌細胞排列不規則，血管大面積透明樣變化及存在炎性浸潤；益母草顆粒組和桃紅四物湯組子宮腔形態趨于正常，未見明顯炎性浸潤，無上皮細胞損傷，腺體細胞數目增多，間質較致密。

圖1 各組大鼠子宮組織病理形態比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of histopathological patterns of the uterus among various groups of rats（HE staining，×200）

2.3 各組大鼠子宮內膜細胞凋亡程度比較圖2結果顯示：正常組、模型組、益母草顆粒組和桃紅四物湯組子宮內膜細胞凋亡率分別為（6.30±0.36）%、（24.40±2.70）%、（12.28±2.35）%及（13.08±2.70）%，組間比較存在差異（F=101.600，P＜0.001）。進一步比較，模型組大鼠子宮內膜細胞凋亡率高于正常組（P＜0.05），而益母草顆粒組和桃紅四物湯組大鼠子宮內膜細胞凋亡率低于模型組（P＜0.05），益母草顆粒組子宮內膜細胞凋亡率與桃紅四物湯組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠子宮內膜凋亡細胞分布情況見圖3。

圖2 各組大鼠子宮內膜細胞凋亡率比較（±s）Figure 2 Comparison of apoptosis rates of endometrial cells among various groups of rats（±s）

圖3 各組大鼠子宮內膜凋亡細胞分布情況比較（TUNEL法，×200）Figure 3 Comparison of the distribution of apoptotic cells in the endometrium among various groups of rats（TUNEL method，×200）

2.4 各組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1蛋白表達比較表2、圖4、圖5結果顯示：模型組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1蛋白相對表達水平較正常組升高（P＜0.05），而益母草顆粒組和桃紅四物湯組大鼠子宮組織COX-2及TGF-β1蛋白相對表達水平低于模型組（P＜0.05），益母草顆粒組子宮組織COX-2及TGF-β1蛋白相對表達水平與桃紅四物湯組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠子宮組織COX-2蛋白電泳條帶圖像Figure 4 Electrophoretic band images of COX-2 protein in uterus tissues in each group of rats

圖5 各組大鼠子宮組織中TGF-β1蛋白電泳條帶圖像Figure 5 Electrophoretic band images of TGF-β1 protein in uterus tissues in each group of rats

表2 各組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1蛋白表達比較Table 2 Comparison of protein expression of COX-2 and TGF-β1 in the uterine tissues among various groups of rats

2.5 各組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1陽性表達比較表3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1陽性細胞數升高（P＜0.05），益母草顆粒組和核桃紅四物湯組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1陽性細胞數低于模型組（P＜0.05），益母草顆粒組COX-2、TGF-β1陽性細胞數與桃紅四物湯組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1陽性細胞數比較Table 3 Comparison of the number of COX-2 and TGF-β1 positive cells in uterine tissues among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1陽性細胞數比較Table 3 Comparison of the number of COX-2 and TGF-β1 positive cells in uterine tissues among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組益母草顆粒組桃紅四物湯組F值P值鼠數/只9 9 9 9 COX-2陽性細胞數/個5.06±1.02 20.15±2.51①13.96±3.07①②14.55±3.11①②52.990＜0.001 TGF-β1陽性細胞數/個6.10±1.30 16.33±1.05①10.36±1.20①②11.05±1.17①②113.200＜0.001

圖6 各組大鼠子宮組織COX-2及TGF-β1陽性細胞分布情況（免疫組織化學，×200）Figure 6 The distribution of COX-2 and TGF-β1 positive cells in uterus tissues in each group of rats（Immunohistochemistry，×200）

3 討論

正常分娩后，由于子宮肌纖維的縮復作用，胎盤剝離面可及時得以修復，一般在產后5~6周可恢復到非孕狀態，這個過程即為子宮復舊。當復舊功能受阻時，即引起子宮復舊不全，長期復舊不全，易發生子宮肌壁組織纖維化，子宮平滑肌收縮乏力，子宮肌壁血管擴張，不能閉鎖，而導致產后出血延長，殘留蛻膜組織不能及時脫落排出，會產生局部炎癥反應，出現產后腹痛、產后感染、產后惡露不絕等疾病[7]。產后子宮復舊不全的病理機制復雜，與細胞凋亡、炎癥反應、子宮內膜纖維化等密切相關。

子宮內膜發生炎癥反應時，革蘭氏陰性菌合成的毒性物質細菌脂多糖（LPS）誘導粒細胞、子宮內膜上皮細胞、間質細胞、血管內皮細胞分泌炎性細胞因子，通過相應的受體啟動細胞內信號轉導過程，激活核因子κB（NF-κB），引起TNF-α轉錄增多[8]。在子宮修復不全中，NF-κB可調控TNF-α的產生，而TNF-α釋放增加又促進了NF-κB的磷酸化，使NF-κB進一步激活，從而延續炎癥反應的復雜環路調節，導致最初的炎癥信號進一步放大，加重子宮炎癥反應，生成大量NO，使纖溶酶原激活劑含量升高、使溶酶體和激肽等釋放，導致血量增多[9]。本研究結果顯示，益母草顆粒組大鼠血清TNF-α水平低于模型組（P＜0.05），表明益母草顆粒可能通過減少炎癥因子TNF-α分泌，減輕炎癥反應，促進產后子宮復舊不全大鼠子宮的恢復。

TGF-β1被認為是最重要的促纖維化因子之一，是纖維化發生發展中的關鍵啟動因子，能刺激子宮內膜組織上皮細胞數目增加，誘導其向肌成纖維細胞轉變[10]。Smad蛋白是TGF-β1作用的直接底物，TGF-β1與特異性受體結合激活TGF-β1/Smad信號通路，促使成纖維細胞增殖和細胞外基質（ECM）沉積，誘導組織纖維化。既往研究[11-12]已證實，宮腔粘連患者粘連組織中TGF-β1和Smad3上調，提示TGF-β1/Smad3通路激活可促進子宮內膜纖維化。本研究結果顯示，益母草顆粒組大鼠子宮組織TGF-β1表達水平低于模型組（P＜0.05），表明益母草顆粒可能通過抑制子宮組織TGF-β1表達，進而減輕子宮粘連，從而修復大鼠產后子宮復舊不全。

COX-2是一種前列腺素合成酶，被認為是快速反應基因，在正常情況下不表達，但在細胞受到各種刺激如炎癥介質、生長因子、細胞因子、促癌劑等的誘導下迅速合成，參與炎癥過程和腫瘤的發生[13]，還參與介導PGI2和TXA2的生成，進而調控凝血過程[14]。在子宮內膜，COX-2高表達可能與局部血管生成、細胞的增生和抑制免疫監督有關。在體內外實驗中已經發現，COX-2抑制劑可以減少細胞移動、細胞黏附和腫瘤侵襲[15]。本研究結果顯示，產后子宮復舊不全大鼠子宮組織COX-2表達水平升高，經益母草顆粒處理后，其子宮組織COX-2表達水平降低，表明COX-2參與修復子宮復舊不全過程，而益母草顆粒可下調COX-2表達，促進大鼠產后子宮的恢復。

綜上所述，益母草顆粒可有效改善大鼠產后子宮復舊不全，其機制可能與抑制子宮組織COX-2、TGF-β1表達及降低血清TNF-α水平有關，與桃紅四物湯療效相當。