淫羊藿苷通過核轉(zhuǎn)錄因子KappaB通路減輕大鼠椎間盤退變

康小彪，李鵬飛，滕元平，胡鵬

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，河南鄭州 450000）

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration）是造成椎間盤疼痛的最主要原因，其主要病理學(xué)改變?yōu)樗韬思?xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、纖維環(huán)斷裂及細(xì)胞外基質(zhì)合成減少[1]。近些年，隨著我國人口增長及老齡化進程加快，椎間盤退變發(fā)生率升高且趨于年輕化，但目前對椎間盤退變?nèi)詿o理想的治療方案。淫羊藿苷（icariin）是補腎中藥淫羊藿的主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗衰老等藥理學(xué)功效[2-4]。既往研究[5-6]表明，淫羊藿苷可顯著緩解大鼠椎間盤源性腰痛，且劑量越大鎮(zhèn)痛效果越明顯，還可促進退變髓核細(xì)胞增殖、蛋白聚糖及Ⅱ型膠原蛋白合成，減少白細(xì)胞介素（IL）-1β及IL-6表達(dá)，延緩椎間盤的退變，具有廣泛應(yīng)用前景，但其具體作用機制尚不完全清楚。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄子kappa B（NF-κB）信號通路在高糖誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞中被激活。基于此，本研究建立椎間盤退變大鼠模型，探討淫羊藿苷對椎間盤退變的改善作用及對NF-κB信號通路的影響，以期為臨床應(yīng)用淫羊藿苷治療椎間盤退變提供實驗數(shù)據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物60只清潔級健康8周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量180~200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2018-0001。大鼠飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)實驗動物中心，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水，實驗環(huán)境：明暗交替時間（12 h∶12 h）=1∶1，相對濕度50%～65%，室內(nèi)溫度20～25℃。

1.2 試劑與儀器淫羊藿苷（分子量：662.6351；分子式：C32H38O15；純度≥98.0%）購自四川維克奇生物技術(shù)有限公司（批號：39012-04-9）。NF-κB信號通路激活劑脂多糖購自美國Sigma公司；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法試劑盒購自上海羅氏制藥有限公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、NF-κB p65、p-p65等抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-6、IL-1β、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒購自美國ABclonal公司；3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物科技公司。CR21GII低溫高速離心機購自日本日立公司；Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀購自美國賽默飛世爾科技公司；CKX53倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.3 模型制備、分組與給藥采用纖維環(huán)穿刺法制備椎間盤退變大鼠模型[8-9]：將50只大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于鼠板上，腹部剃毛消毒，右側(cè)旁正中做一約2 cm的切口，逐層切開，暴露腹后壁，可見髂嵴正對L6錐體或L5~L6椎間盤。左右髂嵴為定位參照，剪開腹后膜，從脊柱附著點上呈節(jié)段性剝離腰大肌，充分暴露L4~L5、L5~L6椎間盤。22 G針頭穿刺于椎間盤中部，深度約為2 mm，針頭在椎間盤中停留10 s再拔出，穿刺完成后，復(fù)位腹腔內(nèi)容物，依次縫合皮下筋膜、肌肉層和皮膚。根據(jù)術(shù)后大鼠的步態(tài)、進食情況、有無尿潴留以及傷口感染等情況可判斷椎間盤退變模型制備是否成功[10]。另取10只大鼠僅暴露椎間盤2 min，不進行穿刺，作為假手術(shù)組。

4周后，將腰椎穿刺后存活的48只大鼠隨機分為模型組、淫羊藿苷組、激動劑組、激動劑+淫羊藿苷組，每組12只。激動劑+淫羊藿苷組給予淫羊藿苷6.0 g/kg灌胃[11]，尾靜脈注射脂多糖5 mg/kg[12]；淫羊藿苷組給予淫羊藿苷6.0 g/kg灌胃，尾靜脈注射等量（5 mL）生理鹽水；激動劑組給予等量（5 mL）生理鹽水灌胃，尾靜脈注射脂多糖5 mg/kg；假手術(shù)組、模型組給予等量（5 mL）生理鹽水灌胃，尾靜脈注射等量（5 mL）生理鹽水。每日1次，連續(xù)2周。

給藥過程中，激動劑組和激動劑+淫羊藿苷組大鼠由于腹內(nèi)感染各有1只死亡，其余組未有死亡。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 ELISA法檢測血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量 末次給藥2 h后，腹腔麻醉，打開腹腔，主動脈采血，室溫靜置30 min后，以3 000 r/min（離心半徑8 cm）離心10 min，吸取上清液。具體操作步驟按試劑盒說明書進行。最后應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定吸光度（OD）值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，計算各指標(biāo)含量。

1.4.2 HE染色法觀察椎間盤病理學(xué)變化 采血結(jié)束后，頸椎脫臼法將大鼠處死，冰上快速剝離L4~L5和L5~L6椎間盤組織，冰生理鹽水沖洗干凈，將L4~L5椎間盤置于4%多聚甲醛溶液中固定。經(jīng)常規(guī)脫水、石臘包埋、切片（片厚4μm），二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水后，蘇木素染液染色5 min，自來水沖洗干凈，分化液分化30 s，自來水浸泡10 min，伊紅染液染色2 min，自來水沖洗。脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.3 TUNEL染色法測定髓核細(xì)胞凋亡率 L4~L5椎間盤組織石蠟切片脫蠟至水；PBS清洗3次，5 min/次，滴加蛋白酶K工作液于組織上，37℃水浴中反應(yīng)30 min；PBS清洗3次，5 min/次，室溫水解15 min；PBS清洗3次，5 min/次，加封閉液室溫封閉10 min；PBS清洗3次，5 min/次，拭水紙擦干玻片，滴加TUNEL反應(yīng)混合液50μL，37℃避光反應(yīng)1 h；PBS清洗3次，5 min/次，滴加DAPI染液，靜置10 min；雙蒸水沖洗，拭水紙擦干玻片，滴加熒光封片液。熒光顯微鏡下觀察并拍照，波長為360～400 nm，計算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率（%）=呈紅色熒光細(xì)胞/呈藍(lán)色熒光細(xì)胞×100%。

1.4.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測椎間盤組織中NF-κB p65、p-p65，Bax，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量 取L5~L6椎間盤組織，液氮中研磨，加RIPA裂解液充分裂解，低溫高速離心后，吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度；加入5×上樣緩沖液和RIPA裂解液調(diào)整蛋白濃度，100℃煮沸10 min，使蛋白變性穩(wěn)定。進行十二烷基硫酸鈉（SDS）凝膠電泳，每孔上樣20μL，濃縮膠80 V電泳30 min，分離膠120 V電泳1.5 h，0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h；TBST洗膜3次，5 min/次，室溫封閉1 h；分別加NF-κB p65、p-p65、Bax、Bcl-2、GAPDH等一抗（稀釋比1∶1 000）4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，5 min/次，二抗（稀釋比1∶5 000）室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，5 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值/GAPDH灰度值比值為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.4.5 免疫組織化學(xué)法檢測椎間盤組織中p-p65蛋白表達(dá) L4~L5椎間盤組織置于4%多聚甲醛中固定24 h后，采用乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液進行脫鈣7 d，流水沖洗，脫水、包埋、切片（片厚4μm），脫蠟至水。玻片置于PBS中微波15 min，進行抗原修復(fù)，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶20 min，5%BSA室溫封閉20 min，p-p65蛋白一抗（稀釋比1∶200）4℃孵育過夜。二抗孵育1 h，DAB顯色液顯色5 min，雙蒸水終止反應(yīng)，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。棕色部分表示p-p65蛋白表達(dá)陽性。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件計算陽性細(xì)胞積分光密度（IOD）值和總細(xì)胞面積（Area），p-p65蛋白表達(dá)水平用平均光密度（AOD）表示，AOD值=IOD值/Area值。

1.5 統(tǒng)計方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量比較表1結(jié)果顯示：IL-6、IL-1β、TNF-α含量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量升高（均P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量降低（均P＜0.05），激動劑組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量升高（均P＜0.05）；與淫羊藿苷組比較，激動劑+淫羊藿苷組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量升高（均P＜0.05）；與激動劑組比較，激動劑+淫羊藿苷組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量降低（均P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清中白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α含量比較Table 1 Comparison of serum levels of IL-6，IL-1βand TNF-αamong various groups of rats （±s，mg·L-1）

表1 各組大鼠血清中白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α含量比較Table 1 Comparison of serum levels of IL-6，IL-1βand TNF-αamong various groups of rats （±s，mg·L-1）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷組比較；④P＜0.05，與激動劑組比較

組別假手術(shù)組模型組淫羊藿苷組激動劑組激動劑+淫羊藿苷組F值P值鼠數(shù)/只10 12 12 11 11 IL-6 104.28±12.33 366.17±15.74①232.50±12.96①②414.26±16.63①②③298.18±15.72①②③④712.045＜0.001 IL-1β 52.80±8.64 123.62±10.58①78.66±9.27①②178.09±10.82①②③105.54±11.35①②③④234.996＜0.001 TNF-α 37.06±8.24 149.23±8.60①83.84±10.17①②190.22±11.53①②③115.62±12.80①②③④342.489＜0.001

2.2 各組大鼠椎間盤組織病理學(xué)變化比較圖1結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠髓核與纖維環(huán)之間界限清晰、纖維環(huán)結(jié)構(gòu)完整、髓核細(xì)胞排列整齊且均勻；模型組大鼠髓核與纖維環(huán)之間界限模糊、纖維環(huán)排列紊亂且存在縫隙，髓核細(xì)胞聚集、皺縮，基質(zhì)減少；與模型組比較，淫羊藿苷組纖維環(huán)結(jié)構(gòu)和髓核形態(tài)及排列趨于正常；激動劑組大鼠纖維環(huán)存在嚴(yán)重裂隙，髓核細(xì)胞數(shù)量明顯減少，病變程度較模型組嚴(yán)重；激動劑+淫羊藿苷組大鼠椎間盤病變較激動劑組減輕。

圖1 各組大鼠椎間盤組織病理學(xué)變化比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of histopathologicalchanges of intervertebraldisc tissues among various groups of rats（HE staining，×400）

2.3 各組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率比較表2、圖2結(jié)果顯示：髓核細(xì)胞凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率降低，激動劑組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與淫羊藿苷組比較，激動劑+淫羊藿苷組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與激動劑組比較，激動劑+淫羊藿苷組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。

圖2 各組TUNEL陽性染色髓核細(xì)胞分布情況（TUNEL染色，×400）Figure 2 Distribution of TUNEL positive staining nucleus pulposus cells in each group of rats（TUNEL staining，×400）

表2 各組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率比較Table 2 Comparison of apoptosis rate of nucleus pulposus cells among various groups of rats（±s）

表2 各組大鼠髓核細(xì)胞凋亡率比較Table 2 Comparison of apoptosis rate of nucleus pulposus cells among various groups of rats（±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷組比較；④P＜0.05，與激動劑組比較

組別假手術(shù)組模型組淫羊藿苷組激動劑組激動劑+淫羊藿苷組F值P值鼠數(shù)/只10 12 12 11 11細(xì)胞凋亡率/%2.14±0.75 9.84±0.83①6.12±0.76①②15.73±0.68①②③8.03±0.62①②③④497.425＜0.001

2.4 各組大鼠椎間盤組織中Bax、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較表3、圖3結(jié)果顯示：Bax、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組Bax蛋白相對表達(dá)量升高，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低（均P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組Bax蛋白相對表達(dá)量降低、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量升高，激動劑組Bax蛋白相對表達(dá)量升高、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低（均P＜0.05）；與淫羊藿苷組比較，激動劑+淫羊藿苷組Bax蛋白相對表達(dá)量升高，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低（均P＜0.05）；與激動劑組比較，激動劑+淫羊藿苷組Bax蛋白相對表達(dá)量降低，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量升高（均P＜0.05）。

表3 各組大鼠椎間盤組織中Bax、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較Table 3 Comparison of protein relative expression levels of Bax and Bcl-2 in intervertebral disc tissues among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠椎間盤組織中Bax、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較Table 3 Comparison of protein relative expression levels of Bax and Bcl-2 in intervertebral disc tissues among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷組比較；④P＜0.05，與激動劑組比較

組別假手術(shù)組模型組淫羊藿苷組激動劑組激動劑+淫羊藿苷組F值P值鼠數(shù)/只10 12 12 11 11 Bax 0.16±0.05 0.62±0.07①0.33±0.07①②0.87±0.08①②③0.51±0.06①②③④176.165＜0.001 Bcl-2 0.87±0.04 0.30±0.07①0.75±0.05①②0.15±0.04①②③0.56±0.06①②③④341.964＜0.001

圖3 Bax、Bcl-2的Western Blot電泳條帶Figure 3 Western Blot electrophoresis bands of Bax and Bcl-2

2.5 各組大鼠椎間盤組織中NF-κB p65、p-p65蛋白相對表達(dá)量比較表4、圖4結(jié)果顯示：p-p65蛋白相對表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組p-p65蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組p-p65蛋白相對表達(dá)量降低，激動劑組p-p65蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；與淫羊藿苷組比較，激動劑+淫羊藿苷組p-p65蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；與激動劑組比較，激動劑+淫羊藿苷組p-p65蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05）。NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 p-p65、NF-κB p65的Western Blot電泳條帶Figure 4 Western Blot electrophoresis bands of p-p65 and NF-κB p65

表4 各組大鼠椎間盤組織中NF-κB p65、p-p65蛋白相對表達(dá)量比較Table 4 Comparison of protein relative expression levels of NF-κB p65 and p-p65 in intervertebral disc tissues among various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠椎間盤組織中NF-κB p65、p-p65蛋白相對表達(dá)量比較Table 4 Comparison of protein relative expression levels of NF-κB p65 and p-p65 in intervertebral disc tissues among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷組比較；④P＜0.05，與激動劑組比較

組別假手術(shù)組模型組淫羊藿苷組激動劑組激動劑+淫羊藿苷組F值P值鼠數(shù)/只10 12 12 11 11 p-p65 0.24±0.08 0.73±0.07①0.32±0.07①②0.95±0.05①②③0.46±0.06①②③④215.815＜0.001 NF-κB p65 1.02±0.05 1.02±0.07 1.03±0.06 1.06±0.07 0.98±0.08 2.012 0.107

2.6 各組大鼠椎間盤組織中p-p65蛋白陽性表達(dá)比較表5、圖5結(jié)果顯示：p-p65平均光密度值組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組p-p65平均光密度值升高（P＜0.05）；與模型組比較，淫羊藿苷組p-p65平均光密度值降低，激動劑組p-p65平均光密度值升高（P＜0.05）；與淫羊藿苷組比較，激動劑+淫羊藿苷組p-p65平均光密度值升高（P＜0.05）；與激動劑組比較，激動劑+淫羊藿苷組p-p65平均光密度值降低（P＜0.05）。

表5 各組大鼠椎間盤組織中p-p65蛋白陽性表達(dá)比較Table 5 Comparison of p-p65 protein-positive expression in intervertebraldisc tissues among various groups of rats （±s）

表5 各組大鼠椎間盤組織中p-p65蛋白陽性表達(dá)比較Table 5 Comparison of p-p65 protein-positive expression in intervertebraldisc tissues among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與淫羊藿苷組比較；④P＜0.05，與激動劑組比較

組別假手術(shù)組模型組淫羊藿苷組激動劑組激動劑+淫羊藿苷組F值P值鼠數(shù)/只10 12 12 11 11 p-p65平均光密度值0.02±0.005 0.16±0.010①0.08±0.007①②0.25±0.013①②③0.12±0.011①②③④859.095＜0.001

圖5 各組大鼠椎間盤組織中p-p65免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果（×400）Figure 5 Immunohistochemicalstaining results of p-p65 in intervertebraldisc tissues in each group of rats（×400）

3 討論

炎癥和髓核細(xì)胞凋亡是發(fā)生椎間盤退變的重要因素。研究[13-15]表明，抑制炎癥反應(yīng)和髓核細(xì)胞凋亡，可改善大鼠椎間盤退變。IL-1是一種強有力的炎癥因子，當(dāng)椎間盤受到損傷時，局部的單核細(xì)胞應(yīng)激產(chǎn)生IL-1，而IL-1可募集更多的炎性細(xì)胞聚集，并誘導(dǎo)炎性細(xì)胞分泌多種炎性介質(zhì)，從而催化椎間盤組織發(fā)生炎癥反應(yīng)[16]。而IL-1β作為IL-1最主要的亞型，可通過多條信號通路，放大炎性反應(yīng)，加重椎間盤損傷。IL-6作為炎癥反應(yīng)的催化劑和媒介，同樣在椎間盤退變中發(fā)揮重要的作用[17-18]。TNF-α是急性炎癥期的主要炎性因子，參與炎癥級聯(lián)反應(yīng)，并可引起細(xì)胞凋亡[17]。本研究結(jié)果顯示：椎間盤退變大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量明顯升高，采用HE染色法觀察椎間盤組織病理學(xué)變化，可見椎間盤退變大鼠椎間盤與纖維環(huán)界限模糊、纖維環(huán)排列紊亂且存在縫隙，髓核細(xì)胞聚集、皺縮、減少，淫羊藿苷治療后血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量等指標(biāo)降低，且椎間盤組織中纖維環(huán)結(jié)構(gòu)和髓核形態(tài)及排列趨于正常，表明淫羊藿苷可減輕椎間盤退變大鼠的炎癥反應(yīng)，改善椎間盤組織損傷。

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的關(guān)鍵組成成員，Bcl-2/Bax通過線粒體依賴途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡，Bcl-2位于線粒體膜上，可抑制線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C泄露至胞質(zhì)并阻斷鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，使依賴細(xì)胞色素C和鈣離子的核酸內(nèi)切酶活性降低，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。Bax與Bcl-2形成異源二聚體，可抑制Bcl-2，發(fā)揮促細(xì)胞凋亡作用[19]。本研究結(jié)果顯示：椎間盤退變大鼠椎間盤組織Bax蛋白相對表達(dá)量升高、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低，髓核細(xì)胞凋亡率亦增加，淫羊藿苷治療后，Bax蛋白相對表達(dá)量降低、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量升高，且髓核細(xì)胞凋亡率降低，表明淫羊藿苷可調(diào)節(jié)椎間盤退變大鼠椎間盤組織Bax/Bcl-2，抗髓核細(xì)胞凋亡。

NF-κB信號通路參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡，而且與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，在細(xì)胞不受外界刺激的情況下，主要以p65和p50二聚體的形式與IκB結(jié)合位于胞漿內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后，IκB發(fā)生磷酸化而被降解，暴露NF-κB二聚體，并從胞漿轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，從而調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄，其中包括促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)。為進一步探討淫羊藿苷是否通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路改善椎間盤退變，本研究應(yīng)用NF-κB信號通路激活劑脂多糖激活該信號通路，采用免疫組織化學(xué)法和Western Blot法檢測p-p65表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路被激活后p-p65活化水平升高，淫羊藿苷治療后可降低p-p65的活化水平。同時采用Western Blot法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，NF-κB信號通路激活可促進凋亡蛋白Bax表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bax表達(dá)，淫羊藿苷治療則發(fā)揮反向作用，表明淫羊藿苷可能通過抑制NF-κB信號通路抗髓核細(xì)胞凋亡，起到保護椎間盤組織的作用。

綜上所述，淫羊藿苷可改善椎間盤退變大鼠椎間盤病理損傷、減輕炎癥反應(yīng)、抑制髓核細(xì)胞凋亡，其機制可能與調(diào)控NF-κB信號通路有關(guān)。