石斛乙醇提取物對2型糖尿病大鼠視網膜血管生成的影響

金昱，呂璐

（1.山東中醫藥大學第一臨床醫學院，山東濟南 250014；2.山東中醫藥大學附屬醫院眼科，山東濟南 250011）

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy）是糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）[1]的一種特定微型血管并發癥，以視網膜血管改變為病理特征，主要臨床表現為眼底視網膜滲出水腫、新生血管、出血及增殖膜形成等，可導致患者視力下降甚至失明[2]。石斛作為名貴中藥材，性微寒，味甘，歸胃、腎經，具有益胃生津，滋陰清熱之功效，可用于目暗不明、陰傷津虧、口干煩渴等癥。石斛的常用制劑方法有水提取和醇提取，可有效提取石斛中極性較大的成分。已有研究顯示，采用乙醇提取的石斛提取物較水提物的抑癌作用高[3]。石斛乙醇提取物也已被證實有提高機體自身免疫，抑制血管形成，緩解眼部疲勞，改善糖尿病及炎性癥狀、眼部循環等作用[4-7]。因此，本研究擬通過構建T2DM模型，探討石斛乙醇提取物對T2DM大鼠視網膜血管生成的作用及機制，以期為石斛乙醇提取物相關藥物的研發和T2DM的臨床治療提供基礎，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物取105只8周齡SPF級雄性健康大鼠，體質量為180~220 g，均購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，生產許可證號：SCXK（京）2018-0002。大鼠飼養于山東中醫藥大學附屬醫院，使用許可證號：SYXK（魯）2018-0015，環境：溫度23~25℃，相對濕度50%~70%，光照晝夜交替循環12 h/12 h。適應性飼養1周。

1.2 藥物、試劑與儀器 鐵皮石斛（干燥莖），購自山東中醫藥大學第一臨床醫學院藥房；羥苯磺酸鈣（批準文號：國藥準字H20030087），南京長澳制藥有限公司生產。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），北京Solarbio公司；白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒，美國Abcam公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒，美國Santa Cruz公司；兔抗大鼠缺氧誘導因子1α（HIF-1α）多抗，血管內皮生長因子（VEGF）多抗，美國Bioworld公司；羊抗兔二抗-辣根過氧化物酶（HRP），美國Abcam公司。光學顯微鏡，深圳市諾視奇科技有限公司；電泳儀、垂直電泳槽，美國Bio-Rad公司。

1.3 石斛乙醇提取物的制備參照文獻方法[8]，取鐵皮石斛干燥莖，用10倍量不同濃度的乙醇回流提取，合并提取液后減壓濃縮，經濾過、萃取、減壓回收，硅膠柱色譜分離后，采用制備薄層及重結晶等方法進行純化，得到提取物。

1.4 建模、分組與干預方法T2DM建模方法[9]：隨機選取85只大鼠禁食1 d，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，一次性給予尾靜脈注射35 mg·kg-1STZ溶液誘導T2DM模型，送回鼠籠飼養。3 d后血糖儀檢測血漿空腹血糖（FPG），FPG≥16.7 mmol·L-1即為建模成功。取建模成功的80只大鼠，隨機分為模型組，石斛提取物低、高劑量組與陽性藥物組，每組20只；余下20只設為正常組。參照文獻研究[10]用量并根據黃繼漢等[11]的動物與人體間等效劑量換算公式計算大鼠給藥劑量。石斛提取物低、高劑量組分別給予石斛乙醇提取物100、300 mg·kg-1灌胃，陽性藥物組給予羥苯磺酸鈣5.4 mg·kg-1灌胃，正常組和模型組則給予等體積生理鹽水灌胃。每日1次，持續12周。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 糖尿病常規指標檢測 分別在干預治療后6、12周，各組大鼠禁食1 d，取尾靜脈血，應用血糖自動檢測儀、碘（125I）胰島素放射免疫分析試劑盒分別檢測大鼠血漿FPG、血清空腹胰島素（FINs）含量。

1.5.2 視網膜組織血管變化 末次采血后，每組隨機選取4只大鼠，采用熒光素眼底血管造影術檢查（fluorescein fundus angiography，FFA）法觀察大鼠視網膜組織血管的變化情況。滴入復方托吡卡胺滴眼液散瞳，然后注射90 g·L-1特殊藥物熒光素鈉（1 mg·kg-1），采用血管造影儀觀察大鼠視網膜血管的變化情況。

1.5.3 組織樣品采集 FFA法檢查結束后，處死各組剩余16只大鼠，取視網膜組織，每組取4只大鼠的視網膜組織，置于4%多聚甲醛固定備用，余下大鼠視網膜組織則置于-80℃冰箱存儲備用。

1.5.4 蘇木素-伊紅染色法觀察視網膜組織病理學變化 取4%多聚甲醛固定備用視網膜組織，石蠟包埋，切片（厚5μm），加熱脫蠟。蘇木素染色（3~5 min），清洗，切片置于1%（V/V）H2O2中浸泡10~30 s，水洗，伊紅染色（20 min）。脫水，透明，中性樹脂封固，光學顯微鏡下觀察。

1.5.5 ELISA法測定視網膜組織炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量 取-80℃存儲備用視網膜組織，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）勻漿、離心，取上清液。按IL-6、IL-1β、TNF-αELISA試劑盒說明書步驟操作：抗體包被過夜（4℃）、洗滌，加入待測抗原和辣根過氧化物酶標記抗原（37℃、60 min），加底物液（37℃、20 min），加終止液。使用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值，根據標準曲線計算視網膜組織中IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.5.6 PCR法檢測視網膜組織HIF-1α、VEGF基因表達 取-80℃存儲備用視網膜組織研磨，TRIzol法提取總RNA，測定RNA純度及濃度，逆轉錄得cDNA，實時熒光定量PCR反應。反應體系：1μL Taq聚合酶、1μL上下游引物、4μL模板cDNA、18μL ddH2O。擴增條件：預變性（95℃，300 s）、變性（95℃，30 s）、退火（60℃，30 s），共計40個循環，繪制熔解曲線，降溫（50℃，30 s）。以β-actin為內參基因，采用2-△△Ct法對目的基因進行相對定量分析，重復3次，取Ct均值。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5.7 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測視網膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達 取-80℃存儲備用視網膜組織，添加RIPA裂解緩沖液，離心，取上清液，以蛋白定量BCA試劑盒測定總蛋白濃度，上樣，進行電泳。電泳結束后，將蛋白電轉至PVDF膜，置于5%脫脂牛奶（25℃，封閉2 h），加入HIF-1α（1∶500稀釋）、VEGF（1∶500稀釋）一抗孵育（4℃，24 h），TBST緩沖液洗膜，再加二抗（1∶1 000稀釋）孵育（25℃，2 h），洗膜，曝光，顯影。以ImageJ軟件測定HIF-1α、VEGF及β-actin條帶灰度值。目標蛋白相對表達水平用目標條帶與β-actin條帶灰度比值表示。

1.6 統計方法采用SPSS 27.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本間進行LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠FPG、FINs值比較表2結果顯示：干預后6、12周后FPG、FINs指標組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組FPG、FINs值升高（P＜0.05）；與模型組比較，石斛提取物低、高劑量組及陽性藥物組FPG、FINs值降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，石斛提取物低、高劑量組FPG、FINs值升高，但石斛提取物高劑量組與陽性藥物組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINs）值比較Table 2 Comparison of FPG and FINs values of rats among various groups （±s）

表2 各組大鼠空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINs）值比較Table 2 Comparison of FPG and FINs values of rats among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽性藥物組比較

組別正常組模型組石斛提取物低劑量組石斛提取物高劑量組陽性藥物組F值P值鼠數/只20 20 20 20 20 FPG/（mmol·L-1）干預6周4.76±0.61 17.82±0.97①16.35±0.92①②③12.28±0.85①②11.91±0.78①②740.281＜0.001干預12周4.64±0.62 17.35±0.94①15.56±0.90①②③11.41±0.52①②11.12±0.67①②863.216＜0.001 FINs/（μU·L-1）干預6周19.65±1.70 28.84±1.59①24.48±1.17①②③21.37±1.68①②20.98±1.57①②112.295＜0.001干預12周19.07±1.68 29.50±1.47①23.42±1.10①②③20.23±0.92①②20.02±0.83①②215.011＜0.001

2.2 各組大鼠視網膜組織血管變化比較圖1結果顯示：正常組大鼠眼底血管分布均勻、熒光素無泄露；模型組大鼠視網膜組織有大量血管生成，且熒光素泄露嚴重；石斛提取物低劑量組大鼠眼底血管數量較模型組減少、熒光素泄露量降低，而石斛提取物高劑量組及陽性藥物組視網膜組織血管數量相對較少、幾乎無熒光素泄露。

圖1 各組大鼠視網膜組織血管變化比較（FFA法）Figure 1 Comparison of vascular changes in rat retinal tissues among various groups（FFA method）

2.3 各組大鼠視網膜組織病理學變化比較圖2結果顯示：正常組大鼠視網膜組織結構及內外界膜清晰、神經纖維層排列整齊，無顯著病理學變化；模型組視網膜組織結構疏松、內外核層細胞排列混亂，可明顯觀察到組織水腫；石斛提取物低劑量組視網膜組織細胞排列稍混亂，出現不同程度組織水腫，神經纖維層增厚；石斛提取物高劑量組和陽性藥物組視網膜組織結構相對清晰，神經纖維層排列相對整齊，出現輕微的組織水腫。

圖2 各組大鼠視網膜組織病理學變化比較（HE染色法，×400）Figure 2 Comparison of histopathologicalchanges in rat retina among various groups（HE staining method，×400）

2.4 各組大鼠視網膜組織炎癥因子含量比較表3結果顯示：視網膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組視網膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，石斛提取物低、高劑量組及陽性藥物組視網膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05）；石斛提取物低、高劑量組視網膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平高于陽性藥物組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠視網膜組織炎癥因子含量比較Table 3 Comparison of the inflammatory factor content in rat retinaltissues among various groups （±s，ng·L-1）

表3 各組大鼠視網膜組織炎癥因子含量比較Table 3 Comparison of the inflammatory factor content in rat retinaltissues among various groups （±s，ng·L-1）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽性對照組比較；④P＜0.05，與石斛提取物低劑量組比較

組別對照組模型組石斛提取物低劑量組石斛提取物高劑量組陽性藥物組F值P值鼠數/只4 4 4 4 4 IL-6 86.24±1.69 131.04±1.76①116.08±1.24①②③97.50±1.58①②③④92.11±1.33①②584.507＜0.001 IL-1β 27.39±1.11 49.63±2.03①43.00±1.95①②③37.46±1.26①②③④32.28±1.87①②107.712＜0.001 TNF-α 285.17±35.12 507.82±42.37①450.69±43.69①②③402.11±38.33①②③④349.03±36.74①②19.245＜0.001

2.5 各組大鼠視網膜組織HIF-1α、VEGF基因表達比較表4結果顯示：視網膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達量組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組視網膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達量升高（P＜0.05）；與模型組比較，石斛提取物低、高劑量組及陽性藥物組視網膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達量降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，石斛提取物低劑量組視網膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達量升高（P＜0.05），而石斛提取物高劑量組與陽性藥物組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠視網膜組織缺氧誘導因子1α（HIF-1α）、血管內皮生長因子（VEGF）基因表達比較Table 4 Comparison of HIF-1αand VEGF gene expression in rat retinaltissues among various groups （±s）

表4 各組大鼠視網膜組織缺氧誘導因子1α（HIF-1α）、血管內皮生長因子（VEGF）基因表達比較Table 4 Comparison of HIF-1αand VEGF gene expression in rat retinaltissues among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽性對照組比較

組別正常組模型組石斛提取物低劑量組石斛提取物高劑量組陽性藥物組F值P值鼠數/只4 4 4 4 4 HIF-1αmRNA相對表達量1.05±0.11 2.61±0.17①2.15±0.16①②③1.67±0.09①②1.76±0.10①②79.580＜0.001 VEGF mRNA相對表達量0.97±0.10 2.89±0.21①2.34±0.13①②③1.87±0.12①②1.96±0.17①②86.917＜0.001

2.6 各組大鼠視網膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達比較圖3、表5結果顯示：視網膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達量組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組視網膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達量升高（P＜0.05）；與模型組比較，石斛提取物低、高劑量組及陽性藥物組視網膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達量降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，石斛提取物低劑量組視網膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達量升高（P＜0.05），而石斛提取物高劑量組與陽性藥物組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表5 各組大鼠視網膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達水平比較Table 5 Comparison of protein expression levels of HIF-1αand VEGF in rat retinaltissues among various groups （±s）

表5 各組大鼠視網膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達水平比較Table 5 Comparison of protein expression levels of HIF-1αand VEGF in rat retinaltissues among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽性對照組比較

組別正常組模型組石斛提取物低劑量組石斛提取物高劑量組陽性藥物組F值P值鼠數/只4 4 4 4 4 HIF-1α蛋白相對表達量0.60±0.08 0.97±0.10①0.83±0.04①②③0.72±0.05①②0.70±0.01①②19.350＜0.001 VEGF蛋白相對表達量0.23±0.05 0.59±0.09①0.47±0.03①②③0.34±0.02①②0.32±0.01①②33.083＜0.001

圖3 各組HIF-1α、VEGF蛋白的Western Blot電泳條帶Figure 3 Western Blot electrophoresis bands of HIF-1αand VEGF proteins

3 討論

炎癥和血管生成為糖尿病視網膜病變的兩個主要機制，其更多地作為相互影響而不是獨立起作用[12]。本研究采用FFA法結果顯示：石斛提取物低劑量組大鼠眼底血管數量較模型組減少、熒光素泄露量降低，而石斛提取物高劑量組及陽性藥物組視網膜組織血管數量相對較少、幾乎無熒光素泄露；HE結果顯示，石斛乙醇提取物低、高劑量組與陽性藥物組視網膜組織結構、內外核層細胞排列以及細胞組織水腫均較模型組呈現出不同程度的改善，其中高劑量組和陽性藥物組大鼠視網膜組織改善更為明顯，且療效相當。結果表明，石斛乙醇提取物可有效抑制T2DM大鼠視網膜新生血管形成，改善大鼠視網膜病變。

炎癥是糖尿病和代謝綜合征發病過程的核心環節。慢性炎癥可引起胰島素抵抗增加和葡萄糖代謝紊亂[13]。本研究結果顯示：石斛乙醇提取物低、高劑量組與陽性藥物組視網膜組織炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平較模型組降低，且高劑量組的改善效果與陽性藥物組相當。結果表明石斛乙醇提取物可減輕T2DM大鼠炎性反應，改善視網膜病變。

HIF是一種成熟且有效的血管生成刺激劑，可誘導缺氧細胞促血管生成因子VEGF轉錄[14]。HIF-α信號在炎癥啟動或調節中起關鍵作用[15]。VEGF是視網膜血管通透性和血管生成的有效誘導劑，通過與相對應受體結合，誘導并參與新生血管形成[16]。HIF因子蓄積可促進VEGF基因表達，加劇以血管過度增殖或產生促癌作用為特征的病理變化[17]。本研究結果顯示，石斛乙醇提取物低、高劑量組與陽性藥物組視網膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達較模型組降低，且高劑量組與陽性藥物組療效相當，表明石斛乙醇提取物可有效調控T2DM大鼠視網膜血管的生成作用靶點。

VEGF表達量與糖尿病視網膜病變程度存在顯著相關性[18]。已有研究[19]結果表明，對T2DM視網膜的保護作用可通過調控HIF-1α/VEGF軸實現。陽性對照藥物羥苯磺酸鈣可作用于VEGF和相對應受體信號通路抑制視網膜微血管形成[20]。本研究結果顯示，石斛乙醇提取物可有效降低T2DM大鼠HIF-1α和VEGF蛋白表達，效果與羥苯磺酸鈣相當，表明石斛乙醇提取物可能通過抑制HIF-α和VEGF的蛋白表達，參與調節血管生成，從而抑制T2DM大鼠視網膜微血管生成。

綜上所述，石斛乙醇提取物可有效抑制T2DM大鼠眼底視網膜血管生成，其機制可能與調控HIF-1α/VEGF軸相關信號分子mRNA和蛋白表達及下游促炎癥因子有關。