桑黃素抑制巨噬細胞氧化應激反應的體外研究※

于 婧 馮丹丹 趙 靖 潘文森△

(1.河北醫科大學第二醫院呼吸與危重癥醫學二科，河北 石家莊 050000；2.河北醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學研究室，河北 石家莊 050017)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)通常可由多種疾病觸發，包括休克、敗血癥、肺炎、胰腺炎、輸血、藥物過量、嚴重創傷和外科手術等，是臨床常見的危重癥疾病之一。ALI這一名詞雖然至今未在中醫學中有所記載，但關于ALI的癥狀已在多部中醫古籍中描述。如《素問·咳論》載 “肺咳之狀，咳而喘息有音，甚則唾血”，又如《靈樞·五閱五使》載“故肺病者，喘息鼻張”，《靈樞·本臟》“肺高則上氣，肩息咳”。同時，有學者將ALI癥狀總結為“喘”“昏”“滿”“熱”四證[1]。現代醫學認為，ALI患者可能出現胸痛、胸悶、氣短，嚴重時會出現咯血、呼吸窘迫、呼吸衰竭、嗜睡甚至昏迷等癥狀。對于ALI的治療，盡管目前呼吸支持及重癥監護患者管理技術的發展取得了進步，但死亡率仍然高達40%以上[2]。近年來，隨著人們對中醫藥治療ALI的不斷探索，發現單味中藥或者復方制劑在清熱解毒、通腑瀉肺、活血化瘀、益氣扶正等多方面對ALI的治療取得一定療效[3]。桑黃素(Morin)(2',3,4',5,7-五羥基黃酮)是從多種植物中分離得到的天然活性物質，屬于黃酮類化合物。已有大量研究表明，Morin具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等多種特性[4-5]，且有證據表明氧化應激(oxidative stress)是參與ALI病理進展的關鍵事件之一[6-7]。

本研究通過使用脂多糖(LPS)誘導體外培養的RAW 264.7巨噬細胞極化，模仿LPS誘導的ALI發生時巨噬細胞的變化，旨在觀察Morin對LPS誘導的巨噬細胞氧化應激反應的影響，為尋找ALI有效治療方法提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 小鼠巨噬細胞RAW 264.7(Procell CL-0190)，購自武漢普諾賽生命科技有限公司；RAW 264.7細胞株，培養于含有青霉素、鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM培養基中，待細胞融合達80%時，吸走部分培養基，然后用無菌細胞刮將細胞刮落，吹打后接種到新的裝有新鮮培養液的培養瓶中。放置于37 ℃、含5%二氧化碳(CO2)的細胞培養箱中繼續培養。

1.1.2 試劑 Morin、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、二甲基亞砜(methyl sulfoxide，DMSO)、細胞裂解液和四唑鹽(MTT)，均購自美國Sigma公司，貨號分別為M4008、L2880、D2650、R0278和M2003；還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶1(NADPH oxidase 1, NOX1)抗體、NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4, NOX4)抗體、核因子2相關因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)抗體、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)抗體和β-actin抗體，均購自武漢三鷹生物技術有限公司，貨號分別為17772-1-AP、14347-1-AP、16396-1-AP、10701-1-AP和66009-1-Ig；Total RNA提取試劑盒(美國OMEGA公司，貨號R6934)；反轉錄試劑盒(美國ThermoFisher公司，貨號K1622)；SYBR Green Master Mix(美國Invitrogen公司，貨號A25778)；臺盼藍(美國Invitrogen公司，貨號T10282)。

1.1.3 儀器 NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo公司)；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)儀(美國Bio-Rad公司)；電泳儀及電泳槽(美國Bio-Rad公司)；電化學發光儀(法國Vilber Lourmat公司)；全自動酶標儀(美國Molecular Devices公司)；Countess自動細胞計數儀(美國Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組和處理 預先使用12.5 μmol/L和25.0 μmol/L 2種濃度的Morin單獨作用或與LPS(1 mg/L)共同處理巨噬細胞，發現對巨噬細胞活力均未造成影響，實驗中我們選用25.0 μmol/L作為Morin的處理濃度。巨噬細胞RAW 264.7分為DMSO組(DMSO)、LPS組(LPS 1 mg/L)、Morin組(Morin 25.0 μmol/L)、LPS+Morin組(LPS 1 mg/L + Morin 25.0 μmol/L)。觀察Morin對LPS誘導的巨噬細胞的作用。取對數生長期的巨噬細胞，計數后，按所需密度接種于6孔板或細胞培養皿中，待細胞長至密度約為80%～90%時，用Morin(25.0 μmol/L)預處理RAW 264.7細胞后，予LPS(1 mg/L)刺激24 h，收集細胞用于后續實驗。

1.2.2 3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四氮唑溴鹽(MTT)比色法 按照1×104個/孔的細胞濃度將RAW 264.7細胞接種于96孔板上，待細胞充分貼壁后，按照實驗設計予細胞刺激24 h。隨后，將培養基更換為100 μL無血清DMEM，并加入MTT染色液10 μL，放回培養箱中避光37 ℃培養4 h。設置全自動酶標儀檢測波長為490 nm，并放置細胞進行吸光度值檢測。每個處理樣品設置5個復孔，實驗重復3次。

1.2.3 蛋白免疫印跡(western blot，WB)檢測 收取各組細胞于離心管中，根據細胞數量加入合適劑量的蛋白裂解液，充分震蕩后超聲裂解細胞，提取細胞總蛋白，二辛可寧酸(bicinchoninicacid，BCA)法定量，加入上樣緩沖液(稀釋5倍)充分混勻后沸水浴5 min。10%分離膠十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳分離蛋白，經轉膜、牛奶封閉、一抗孵育4 ℃過夜、二抗孵育后進行化學發光。Image J圖像處理系統分析條帶灰度值。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測 將各組細胞收集于EP管中，根據細胞數量加入適量Trizol處理液，總RNA提取按照Total RNA提取試劑盒說明書的步驟進行。反轉錄后獲得cDNA。加入引物和熒光PCR染料法混合物SYBR mix配置RT-PCR反應體系，每組樣本設置3個副孔，反應條件為95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，循環39次。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成，各基因引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

2 結果

2.1 Morin對巨噬細胞活力影響 Morin在12.5 μmol/L和25.0 μmol/L 濃度劑量下，單獨作用或與LPS(1 mg/L)共同處理巨噬細胞24 h，均未對巨噬細胞活力造成顯著影響(P>0.05)。后續實驗中選用25.0 μmol/L作為Morin的處理濃度。MTT比色法檢測不同處理對巨噬細胞活力影響見圖1。

圖1 MTT比色法檢測不同處理對巨噬細胞活力的影響

2.2 Morin對LPS刺激下巨噬細胞NOX1 mRNA、NOX4 mRNA表達水平影響 與DMSO組比較，LPS處理組巨噬細胞中NOX1 mRNA和NOX4 mRNA水平較DMSO處理顯著上調(P<0.05，P<0.01)，單獨予Morin處理對巨噬細胞中NOX1 mRNA和NOX4 mRNA水平影響無統計學意義(P>0.05)。與LPS處理組比較，Morin給藥組巨噬細胞中NOX1 mRNA和NOX4 mRNA水平顯著降低(P<0.05)。各組巨噬細胞中NOX1 mRNA和NOX4 mRNA表達情況見圖2。

與DMSO組比較，*P<0.05，**P<0.01；與LPS組比較，△P<0.05

2.3 Morin對LPS刺激下巨噬細胞NOX1和NOX4蛋白表達水平的影響 與DMSO組比較，LPS組巨噬細胞中NOX1和NOX4蛋白水平顯著上調(P<0.01)，單獨予Morin處理對巨噬細胞中NOX1和NOX4 蛋白水平影響無統計學意義(P>0.05)。與LPS組比較，Morin組巨噬細胞中NOX1和NOX4的蛋白水平顯著降低(P<0.01)。各組巨噬細胞中NOX1和NOX4蛋白表達情況見圖3。

與DMSO組比較，**P<0.01；與LPS組比較，△△P<0.01

2.4 Morin對LPS刺激下巨噬細胞中Nrf2/HO-1信號通路的影響 與DMSO組比較，LPS處理或Morin處理后巨噬細胞中抗氧化應激指標Nrf2和HO-1蛋白水平顯著增加(P<0.01，P<0.001)。與LPS處理組比較，LPS+Morin處理組Nrf2和HO-1的蛋白表達水平進一步增加(P<0.01)。各組巨噬細胞中Nrf2和HO-1的蛋白表達情況見圖4。

與DMSO組比較，**P<0.01，***P<0.001;與LPS組比較，△△P<0.01

2.5 Morin緩解LPS誘導的巨噬細胞氧化應激的示意圖 見圖5。

圖5 Morin緩解LPS誘導的巨噬細胞氧化應激的示意圖

3 討論

ALI是一種以彌漫性肺泡損傷、炎癥細胞浸潤、肺泡上皮屏障破裂、肺泡水腫、肺氣體交換受損為特征的嚴重、多因素的肺部病變，具有高發病率、高致死率等特點。目前，大多數ALI患者的治療效率低，治療方案主要集中在控制肺部炎癥、小潮氣量機械通氣，液體管理及體外肺氧合等，尚缺乏有效的藥物進行防治[8-9]。

中醫學認為，ALI屬暴喘、喘脫范疇，主要由內傷或外感后肺不主氣或腎不納氣進而導致肺氣上逆或氣不歸元所致。中醫治療ALI主要包括清熱解毒、宣肺通腑、活血化瘀、扶正祛邪、通里攻下、肺腸同治、益氣利血等。已有多項研究表明，中藥在治療呼吸系統疾病中收到良好功效。如中藥制劑蓮花清瘟膠囊聯合常規抗病毒西藥治療新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)感染患者安全有效，并且可預防與感染者密切接觸后COVID-19進展[10-11]。此外，研究顯示痰熱清注射液、參麥注射液等多種中藥制劑均能通過抑制過氧化作用，減輕氧化應激所致肺損傷[12]。Morin是一種在水果、蔬菜中發現的生物類黃酮，最初是從桑科植物中分離出來，作為黃酮類化合物的一種，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及治療糖尿病等多種生物學活性。有研究表明，在LPS誘導的大鼠ALI模型中，Morin能有效緩解ALI 導致的肺泡水腫與肺組織纖維化形成，同時降低ALI模型大鼠外周血清中炎癥因子表達水平[13]。此外，Morin還可降低支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中炎癥細胞數量，顯著抑制LPS誘導的肺組織中性粒細胞浸潤[14]。

氧化應激是影響ALI發展和進程的重要機制之一。在ALI條件下，氧化應激顯著誘導炎癥因子的產生、巨噬細胞和內皮細胞中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的激活及一氧化氮(NO)的分泌，進一步促進了更強氧化劑的產生和氧化損傷的發展[15]。并且氧化應激損傷可通過炎癥對肺泡上皮細胞間接誘導，進一步加速肺泡上皮細胞的壞死和凋亡[16]。紅系衍生的Nrf2是各種細胞氧化應激反應中的關鍵核轉錄因子[17]。有研究表明，Nrf2能參與巨噬細胞代謝和炎癥介質的表達，并且Nrf2的激活對包括急性肺損傷(ALI)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)在內的各種肺部疾病均具有保護作用[18-19]。HO-1是Nrf2依賴性抗氧化防御基因之一，同樣Nrf2/HO-1信號通路的激活調節細胞抗氧化應激并對ALI發揮抗炎和細胞保護作用[20]。Morin可作為Nrf2的外源性激動劑，促進Nrf2的核轉位，進而發揮其抗氧化應激的生物學作用[21]。

本研究采用LPS刺激巨噬細胞，以Morin為干預手段。首先觀察到，當巨噬細胞給予LPS刺激后，作為ROS主要來源的NOX1、NOX4的表達水平較正常DMSO組明顯升高，說明LPS能夠激活巨噬細胞的氧化應激作用。其次觀察了不同組別中Nrf2及其下游產物HO-1的表達情況。結果顯示，LPS+Morin組中Nrf2、HO-1的表達較DMSO組、LPS組及Morin組均升高。這可能是由于Nrf2激活作為對LPS誘導的細胞適應性反應，一旦細胞受到LPS誘導的氧化應激的挑戰，Nrf2的激活就開始了。然而，它無法完全克服LPS的刺激作用，而適應性刺激的Nrf2可能會減輕或延遲LPS的刺激作用。在Morin組中Nrf2及其下游產物HO-1的表達明顯增加，表明Morin給藥可增強這種作用。因此，這支持了Morin通過Nrf2途徑在預防和治療LPS誘導的ALI中可能發揮作用。

綜上所述，Morin可通過激活Nrf2/HO-1信號通路，下調NOX1和NOX4的表達，抑制LPS誘導的巨噬細胞氧化應激反應。本實驗通過研究Morin對LPS誘導巨噬細胞損傷的保護作用及機制，為尋找ALI的有效治療靶點提供了新思路，并為Morin藥理學研究和臨床應用提供了理論基礎。