生物素標記重組豬圓環病毒2d基因型毒株感染性克隆的構建與鑒定

林小楓 ， 劉梅雪 ， 袁瑋藝 ， 張瓊歌 ， 朱 磊 ， 杜 謙

(1.西北農林科技大學動物醫學院 ， 陜西 楊凌 712100 ； 2.楊凌金海生物技術有限公司 ， 陜西 楊凌 712100)

豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是目前嚴重危害養豬業的一種重要病原。PCV2感染能抑制機體免疫，導致豬圓環病毒病綜合征(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)，且PCV2在豬群中的持續存在，給養豬業造成了巨大的損失[1]。PCV2的單鏈環狀DNA基因組包含2個主要的編碼框(Open reading frame，ORF)，即ORF1和ORF2。可根據ORF2基因序列的差異將PCV2分為8個不同的基因型，其中PCV2a、PCV2b和PCV2d是主要的流行基因型[2]。豬群中最早流行PCV2a基因型，然后轉變為PCV2b，目前正緩慢轉變為PCV2d[3-4]。雖然有報道稱，目前市場上銷售的基于PCV2a基因型毒株的疫苗對于PCV2d基因型毒株的保護效果與PCV2a基因型毒株相當，但臨床仍存在已接種PCV2a基因型毒株疫苗的豬發生PCVAD，因此PCV2臨床毒株可能突破疫苗免疫保護[5]。原核生物素連接酶(Prokaryotic biotin ligase，BirA)是原核生物調控生物素合成的酶，生物素受體肽(Biotin acceptor peptide，BAP)是一種廣泛使用的15 aa標簽肽，其可被插入目的蛋白，使目的蛋白被BirA高效識別并標記生物素[6]。利用BirA-BAP標記系統獲得生物素化PCV2d毒株可為后續進一步研究PCV2d感染突破疫苗免疫保護的具體機制提供材料。

本試驗從陜西咸陽某臨床發病豬場采集17頭仔豬的血清、脾臟和淋巴結等組織樣本，PCR檢測發現其中5頭仔豬為PCV2陽性，經測序發現1頭仔豬感染了PCV2d基因型毒株。將PCV2d基因組orf2序列中226～246 bp替換為BAP編碼序列后，環化并轉染穩定表達BirA的PK15細胞，經連續傳代5次后，獲得生物素標記的重組PCV2d基因型毒株，本結果將為后續開展PCV2d基因型毒株免疫逃避機制研究提供有效的工具。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2頭臨床發病仔豬和15頭未發病仔豬的血清、脾臟和淋巴結等組織樣本均采集自陜西咸陽武功縣某養殖場。

1.2 細胞、菌株和質粒 PK15細胞、大腸埃希菌(E.coli)DH5α感受態細胞和pCI-neo-N1質粒，由本實驗室保存；pMD-18T質粒，購自TaKaRa公司。

1.3 主要試劑 2×TaqMaster Mix(Dye plus)和T4連接酶，均購自南京Vazyme公司；SacⅡ、BamH Ⅰ和XhoⅠ等內切酶，均購自TaKaRa公司；M5 DL2 000 plus DNA Marker，購自北京聚合美公司；Lipo6000，購自碧云天公司；鼠抗BirA單克隆抗體，購自NOVUS公司；HRP標記鏈霉親和素，購自Santa Cruz公司；鼠抗PCV2 Cap多克隆抗體，由本實驗室制備并保存。

1.4 試驗方法

1.4.1 引物設計 根據已報道的PCV2(GenBank：MH492006)序列，設計PCV2全長擴增引物PCV2-F和PCV2-R，以及PCV2檢測引物PCV2JC-F和PCV2JC-R；根據PCV2 Cap編碼序列的Loop CD區域(L75PPGGGSN82)，設計引入BAP標簽(GLNDIFEAQKIEWHE)序列的Overlap引物BAP-F和BAP-R；根據大腸埃希菌的BirA基因序列(GenBank：M10123.1)設計引物BirA-F和BirA-R。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4.2 基因組DNA的提取 將采集的組織樣本或細胞經-80 ℃反復凍融，離心取上清。在收集的上清液中加入1%終體積SDS和0.5 mg/μL終濃度蛋白酶K，顛倒混勻1 min，56 ℃水浴30 min。加入等體積DNA提取液，震蕩混勻5 min后，12 000 r/min離心5 min。吸取上清，加入等體積氯仿，混勻5 min后，室溫12 000 r/min離心5 min。吸取上清，加入1/10體積2 mol/L乙酸鈉和2倍體積無水乙醇，-80 ℃過夜。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌2次，4 ℃離心棄上清，自然風干后加入ddH2O溶解，置于-20 ℃備用。

1.4.3 PCV2基因組擴增和遺傳進化分析 利用PCV2檢測引物PCV2JC-F和PCV2JC-R對提取的17份組織DNA樣品進行PCR檢測，設置陽性對照和陰性對照。對于PCV2陽性DNA樣品，利用PCV2全長引物進行PCV2全基因組PCR擴增，回收PCR產物，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。為了明確所擴增PCV2的基因型，利用MEGA 5.10軟件，采用鄰接(Neighbor-joining,NJ)法，并進行1 000次自舉重復，對測序結果進行遺傳進化分析。

1.4.4 重組質粒T-PCV2d-BAP的構建 根據獲得的PCV2d DNA中orf2的226～246 bp序列，分別利用Overlap引物BAP-F和PCV2-R、PCV2-F和BAP-R進行PCR擴增，獲得產物片段1和片段2，以片段1和片段2共同為模板，利用PCV2-F和PCV2-R進行PCR擴增，獲得重組PCV2d-BAP目的片段。將其克隆入pMD19-T載體，轉化E.coliDH5α后挑取單克隆，擴大培養并提取質粒，分別進行PCR及SacII酶切鑒定，并進一步測序鑒定，將構建成功的重組質粒命名為T-PCV2d-BAP。

1.4.5 重組質粒pCI-BirA的構建 取3 mLE.coliDH5α飽和菌液，離心棄上清，STE洗滌1次，加入500 μL TE緩沖液，沸水浴10 min后，以12 000 r /min離心15 min，取上清作為PCR模板。利用BirA-F和BirA-R進行PCR擴增，條件為：95 ℃預變性10 min,94 ℃ 40 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環后，再于72 ℃延伸10 min。回收PCR產物，利用BamH I和XhoI雙酶切，同時對pCI-neo-N1質粒進行雙酶切，回收酶切產物，用T4連接酶于16 ℃過夜連接，轉化E.coliDH5α后挑取單克隆并擴大培養，提取質粒后經PCR、雙酶切和測序鑒定，將構建成功的重組質粒命名為pCI-BirA。

1.4.6 穩定表達BirA的PK15細胞系的構建及鑒定 將狀態良好的PK15細胞以6×104個/孔鋪制24孔細胞板，置于37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養箱培養。待細胞密度達到70%左右時，利用Lipo6000將構建好的重組質粒pCI-BirA轉染至PK15細胞，48 h后加入G418進行篩選，獲得單細胞克隆后擴大培養。收取擴大培養的細胞，提取細胞mRNA，反轉錄為cDNA后，PCR擴增BirA基因編碼序列，同時Western blot檢測細胞中BirA蛋白的表達，PCR和Western blot陽性細胞克隆即為穩定表達BirA的PK15細胞系。

1.4.7 生物素標記PCV2d基因型毒株的獲得及鑒定 利用內切酶SacII將T-PCV2d-BAP酶切，獲得PCV2d-BAP編碼序列，將其以T4連接酶于16 ℃連接過夜，連接產物經純化后，轉染至穩定表達BirA的PK15細胞，盲傳5代后，收取細胞，裂解并收集上清，提取DNA，利用PCV2特異性引物進行PCR檢測，同時將獲得的細胞上清再次感染PK15細胞，裂解細胞后，以鼠抗PCV2 Cap多克隆抗體和HRP標記的鏈酶親和素進行Western blot檢測，陽性毒株即為生物素標記PCV2d基因型毒株。

2 結果

2.1 臨床樣本的檢測及PCV2d全基因組擴增 將采集的2頭發病仔豬和15頭未發病仔豬樣本，分別提取DNA后，以PCV2特異性檢測引物進行PCR擴增，結果顯示，2頭發病仔豬均為PCV2陽性，15頭未發病仔豬中有3頭為PCV2陽性(圖1A)。分別將5頭PCV2核酸陽性仔豬樣本中的PCV2全基因組DNA進行PCR擴增，均得到大小約為1 760 bp的目的條帶(圖1B)。對目的條帶進行測序，并進行遺傳進化分析，結果顯示，擴增的5條目的條帶中有1條為PCV2d序列，擴增自1頭發病仔豬的組織樣本，其余4條為PCV2b序列，分別來源于另一頭發病仔豬和3頭未發病仔豬(圖1C)。

圖1 臨床樣本PCR檢測及PCV2d全基因組遺傳進化分析Fig.1 PCR detection of clinical samples and genetic evolution analysis of PCV2d whole genomeA：17份臨床樣本PCV2特異性PCR擴增(M：DNA標準DL2 000 plus； 1:陽性對照； 2:陰性對照； 3～17:臨床未發病仔豬組織樣本； 18、19:臨床發病仔豬組織樣本);B:5份陽性樣本PCV2全基因組PCR擴增(M:DNA標準DL2 000 plus； 1:陽性對照； 2：陰性對照； 3～7：PCV2陽性臨床樣本)；C：PCV2全基因組遺傳進化樹(▲：本試驗擴增序列)A：PCV2 specific PCR amplification of 17 clinical samples(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:Positive control; 2:Negative control; 3-17:Clinical tissue samples from non-diseased pigs; 18,19:Clinical tissue samples from diseased pigs);B:PCV2 whole genome PCR amplification of 5 positive samples(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:Positive control;2:Negative control; 3-7:PCV2 positive clinical samples);C:Phylogenetic tree of PCV2 genomes(▲:Sequences amplified in this study)

2.2 重組質粒T-PCV2d-BAP的構建 根據獲得的1株PCV2d全基因組DNA中orf2的226～246 bp序列，設計引入BAP序列的Overlap引物，分別進行PCR擴增，獲得大小約為842 bp的PCR片段1和大小約為1 028 bp的PCR片段2(圖2A)。以片段1和片段2同時為模板，用PCV2全基因組引物進行PCR擴增，獲得大小約為1 790 bp的PCV2d-BAP目的條帶(圖2B)，將其克隆入pMD19-T載體，經PCR及SacⅡ酶切鑒定，均獲得了預期大小的目的條帶(圖2C)，測序鑒定正確，表明重組質粒T-PCV2d-BAP構建成功。

圖2 重組質粒T-PCV2d-BAP的構建Fig.2 Construction of recombinant plasmid T-PCV2d-BAPA：PCV2d片段1和片段2的PCR擴增(M：DNA標準DL2 000 plus； 1:片段1； 2:片段2); B:PCV2d-BAP的PCR擴增(M:DNA標準DL2 000 plus； 1:PCV2d-BAP);C:重組質粒T-PCV2d-BAP的Sac Ⅱ酶切鑒定(M:DNA標準DL2 000 plus； 1:Sac II酶切鑒定產物)A:PCR amplification of fragment 1 and fragment 2 of PCV2d(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:Fragment 1; 2:Fragment 2); B:PCR amplification of PCV2d-BAP(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:PCV2d-BAP);C:Identification of recombinant plasmid T-PCV2d-BAP by Sac Ⅱ enzymes digestion(M：DNA Marker DL2 000 plus; 1:Sac Ⅱ enzymes digestion products)

2.3 重組質粒pCI-BirA的構建 設計E.coliDH5αBirA基因特異性引物，經PCR擴增，獲得大小約為966 bp的目的條帶(圖3A)，將其克隆入pCI-neo載體，經雙酶切鑒定，獲得大小約為966 bp的目的條帶(圖3B)，測序鑒定正確，表明已成功構建pCI-BirA重組質粒。

圖3 重組質粒pCI-BirA的構建Fig.3 Construction of recombinant plasmid pCI-BirAA：BirA基因的PCR擴增(M：DNA標準DL2 000 plus； 1:BirA);B:重組質粒pCI-BirA的雙酶切鑒定(M:DNA標準DL2 000 plus； 1:BamH I和Xho I雙酶切產物)A：PCR amplification of BirA gene(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:BirA);B:Identification of recombinant plasmid pCI-BirA by double enzymes digestion(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:BamH I and Xho I double enzymes digestion products)

2.4 穩定表達BirA的PK15細胞系的構建及鑒定 將構建好的pCI-BirA重組質粒轉染PK15細胞，48 h后加入G418進行篩選，獲得單細胞克隆后擴大培養(圖4A)，提取細胞mRNA并反轉錄后，PCR擴增BirA基因編碼序列，結果顯示獲得了大小約為966 bp的目的條帶(圖4B)；Western blot結果顯示，獲得的細胞克隆表達BirA蛋白(圖4C)，與預期大小一致，表明成功獲得了穩定表達BirA的PK15細胞系。

圖4 穩定表達BirA的PK15細胞系的構建及鑒定Fig.4 Construction and identification of PK15 cell line stably expressing BirAA：G418篩選后單克隆擴大培養的PK15細胞(100×)；B：PK15細胞系BirA mRNA的PCR鑒定(M：DNA標準DL2 000 plus； 1:BirA mRNA); C：PK15細胞系BirA蛋白的Western blot鑒定(WT:野生型PK15細胞； BirA:表達BirA的PK15細胞A：Expanded PK15 cells after G418 screening (100×);B：PCR identification of BirA mRNA in PK15 cell line(M:DNA Marker DL2 000; 1:BirA mRNA);C：Western blot identification of BirA protein in PK15 cell line(WT：Wild-type PK15 cells; BirA:PK15 cells expressing BirA)

2.5 生物素標記PCV2d基因型毒株的獲得及鑒定 將環化的PCV2d-BAP轉染穩定表達BirA的PK15細胞，盲傳5代，經檢測，成功獲得大小約為352 bp的目的片段(圖5A)。同時將獲得的上清感染PK15細胞，裂解細胞后進行Western blot檢測，結果顯示，以鼠抗PCV2 Cap多克隆抗體和HRP標記的鏈酶親和素均能檢測到大小約為29 kDa的目的條帶(圖5B)，表明成功獲得了生物素標記PCV2d基因型毒株。

圖5 生物素標記PCV2d基因型毒株的獲得及鑒定Fig.5 Obtain and identification of biotin-labeled PCV2d genotype strainA：細胞裂解上清PCV2特異性PCR鑒定(1：陽性對照； 2：細胞裂解上清； 3：陰性對照)；B：生物素標記PCV2d基因型毒株的Western blot鑒定(1:PCV2陽性對照； 2:生物素標記PCV2d基因型毒株； 3:陰性對照)A：PCV2 specific PCR identification of cell lysis supernatant(1:Positive control; 2:Cell lysis supernatant; 3:Negative control); B：Western blot identification of biotin-labeled PCV2d genotype strain(1:PCV2 positive control; 2:Biotin-labeled PCV2d genotype strain; 3:Negative control)

3 討論

PCV2是目前已知最小的動物病毒，其基因組大小約為1 766～1 768 nt的單鏈環狀DNA。在單鏈DNA病毒中，PCV2基因組具有最高的突變概率，每年能達到約1.2×10-3突變/位點[7]。PCV2基因組的這些突變使其可以被分為不同基因型，分別為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e、PCV2f、PCV2g和PCV2h[2,5]。在目前已報道的PCV2序列中，PCV2b基因型最多，其次是PCV2d基因型，第三是PCV2a基因型，這3種PCV2基因型均呈世界性分布[2]。從PCV2序列報道的時間上來看，最早報道的是PCV2a基因型，但大約從2002年開始，PCV2b基因型的報道增多，特別是2005年以后，PCV2b基因型開始成為主要的流行基因型[2]。隨著PCV2基因組的持續突變，2010年以后PCV2d基因型的報道量急劇增加，并呈現逐漸取代PCV2b基因型成為主要流行基因型的趨勢[2]。更重要的是，有研究顯示，雖然目前廣泛使用的基于PCV2a基因型毒株的疫苗能使免疫后的仔豬在被PCV2a、PCV2b或PCV2d基因型毒株感染時具有相似的保護作用，但在PCV2b和PCV2d基因型毒株感染的仔豬體內中和抗體的產生量相對較少[8]。目前，世界主要養豬國家已廣泛使用PCV2疫苗對豬群進行免疫，但與此同時PCV2d基因型毒株報道增多，這可能與疫苗的選擇壓力有關[5]。事實上，早前已有報道顯示，PCV2在疫苗選擇壓力下已經發生了免疫逃避進化趨向[9]。因此，對豬群中PCV2流行情況的持續監控，以及對流行PCV2基因型的進一步深入研究，將有助于更好地防控豬圓環病毒病。在本試驗中，對臨床發病的2頭仔豬和同豬群未發病的15頭仔豬的組織樣本進行了PCV2核酸檢測，結果顯示，2頭發病仔豬均為PCV2陽性，15頭未發病仔豬中有3頭為PCV2陽性，經進一步測序發現，兩頭發病仔豬中一頭感染了PCV2d基因型毒株，另一頭感染了PCV2b基因型毒株，3頭未發病仔豬均為PCV2b基因型毒株感染，推測本試驗檢測豬群中感染的PCV2基因型仍以PCV2b為主，但出現了PCV2d基因型毒株導致的感染和發病。

PCV2基因組有2個主要的ORF，分別編碼復制酶Rep/Rep′和衣殼蛋白Cap。前期研究發現，PCV2 Cap編碼序列的Loop CD區域(L75PPGGGSN82)可在不改變病毒衣殼結構和入胞能力的情況下插入外源基因[10]。因此，本試驗基于臨床獲得的PCV2d基因型毒株基因組，將Cap的Loop CD區域替換為生物素受體肽BAP編碼序列，構建了能融合表達BAP標簽的PCV2d基因型毒株全基因組。BAP是生物素連接酶BirA的底物，BirA-BAP系統是一種原核生物蛋白質翻譯后生物素化修飾系統[11]。BirA可特異性地識別BAP，并將生物素分子共價結合至BAP的賴氨酸殘基上。這種利用BirA-BAP系統的生物素化標記，已被用于純化蛋白、標記抗體、蛋白功能研究和構建生物素標記重組病毒等[11-12]。本試驗將構建的能融合表達BAP標簽的PCV2d全基因組DNA經環化后，轉染穩定表達BirA的PK15細胞，利用BirA-BAP系統獲得了生物素標記的PCV2d基因型毒株。這種生物素標記的PCV2d基因型毒株將有助于進一步研究PCV2d基因型毒株的感染與免疫逃避機制。但是，這種PCV2d基因型毒株衣殼上標記的生物素能否持續穩定的存在，還需要多代次的擴增后進一步檢測。

綜上所述，本試驗從臨床發病豬群中獲得了1株PCV2d基因型毒株全基因組序列，以此毒株序列為基礎，利用BirA-BAP系統構建了生物素標記PCV2d基因型毒株感染性克隆，獲得了生物素標記的PCV2d毒株，為后續開展PCV2d基因型毒株免疫逃避機制研究提供了基礎。