miR-101基因簇與食管癌發病風險的病例對照研究

王 婷，張雯雯，張永欣，曾 勇，王俊玲，李成云

(蘭州大學公共衛生學院衛生毒理學研究所，甘肅 蘭州 730000)

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內源性非編碼小RNA，長度為21～25 個核苷酸，廣泛存在于真核生物體內，是一類重要的高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，具有調節基因表達活性的功能[1]。大量研究證實miRNA異常表達可能導致腫瘤的發生，并影響其發展和預后[2-3]。Hou 等[4]研究發現miRNA 與食管癌的發生相關，可作為潛在的腫瘤診斷或預后判定標志。

已有研究發現，由兩個或多個相關的miRNA基因組成的miRNA 基因簇(miRNA cluster)總是以多順反子轉錄并具有相似的表達模式[5]，作用共同的靶基因或同一信號通路中的蛋白分子，從而多層次地監控該信號轉導途徑。這種多靶點調控比單個miRNA的作用模式更復雜，功能更高效[6]。而目前關于miRNA 與食管癌的研究多局限于單一或成熟的miRNA。因此，對miRNA基因簇的深入研究有助于更好的探索食管癌發生發展的分子調控機制[7]。

本研究采用高通量芯片測序技術對食管癌患者癌組織及癌旁組織差異表達的miRNAs 表達譜進行分析。基于低表達較為顯著的miR-101-3p，據miRbase數據庫(http://www.mirbase.org/)顯示：miR-101基因簇由has-miR-101-3p、has-miR125a-5p、has-miR-127-5p與has-miR-145-5p 基因共同組成。目前，對于miR-101 基因簇有研究報道has-miR-101-3p 和has-miR-1455p 在食管癌組織中呈現低表達且發揮競爭內源性RNA功能，可影響靶基因功能，調控食管癌發生發展進程，但確切功能機制仍不明確；has-miR125a-5p和has-miR-127-5p 在食管癌調控方面的研究尚未見報道。因此，本研究旨在通過檢測miR-101基因簇編碼的各miRNA在食管癌和癌旁組織中的表達水平，進而分析該基因簇的表達與食管癌發病風險的關系，擬為后續miR-101基因簇在食管癌進程中的調控機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本收集與microRNA芯片高通量檢測

收集并選取甘肅省武威腫瘤醫院2019—2020年收治的食管癌進展期3 例患者(男性2 例，女性1 例)癌組織及其癌旁組織(距癌組織邊緣大于5 cm)新鮮標本進行組織芯片高通量microRNA 檢測；另收集33 例食管癌患者(男性28 例，女性5 例)癌組織及其癌旁新鮮組織標本進行實時熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR，qPCR)檢測。所有食管癌患者術前均未接受放化療及免疫治療，對所采集的全部組織標本進行病理組織形態學檢查，病理檢查采用常規HE染色，并由2 位專職病理醫師完成，食管癌組織標本鏡檢腫瘤組織大于80%，癌旁對照組織鏡檢均未發現腫瘤組織。將采集的組織樣品(約0.5 cm3)浸入RNAlater 中，并在-80 ℃下儲存備用。人群生物樣本收集通過甘肅省蘭州大學公共衛生學院倫理委員會的審查(倫理審查編號為LZUGWLL-180301)。

1.2 TCGA數據庫原始數據下載及分析

選取截止日期為2020年11月1日，進入腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/) 食管癌(esophageal carcinoma，ESCA)頁面，以miRNAseq 數據集所收錄的162 例食管癌組織樣本和11例癌旁對照組織樣本的測序數據作為本研究對象。miRNA 數據選level 3 級別，RNAseq 選項中勾選rsem.genes.normalized_results.txt 文件，在miRNAseq 選項中勾選miRNA.quantification.txt 文件，確定并開始下載。將樣本分組編號并審核是否有完整的轉錄組Illumina Seq System microRNA(Illumina Inc.，Hayward，CA，USA)測序數據。數據的下載和使用均經TCGA 數據庫授權，原始測序結果可用于后續分析使用和公開發表。

1.3 主要試劑和設備

組織microRNA 芯片高通量檢測(南京金麥普生物科技有限公司)；TRIzol 試劑及RNA-later 購自美國賽默飛世爾科技公司；DEPC 購自美國Sigma-Aldrich 公司；miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p、miR-145-5P和U6基因的qPCR引物購自上海生物工程股份有限公司，相關基因引物序列見表1。逆轉錄和qPCR試劑盒購自日本TaKaRa 公司。低溫高速離心機及水平離心機購自美國Beckman 公司；Real time PCR 擴增儀購自美國Bio-Rad 公司；核酸蛋白測定儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

表1 miR-101基因簇相關引物序列

1.4 總RNA提取及qPCR驗證

使用TRIzol 試劑，按試劑說明書操作提取組織總RNA，核酸蛋白測定儀NanoDrop2000檢測RNA純度及濃度。使用反轉錄試劑盒進行miRNA 莖環法逆轉錄，逆轉錄條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃暫存，將cDNA置于-20 ℃冰箱保存。qPCR反應體系為25.0 μL，包括12.5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、10 μmol/L 上下游引物各1.0 μL、2.0 μL RT 反應液(cDNA)、8.5 μL RNase free dH2O。反應條件為：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，55～65 ℃、30 s，40 個循環。U6為內參，每個實驗樣本設置3個復孔，檢測重復3 次。qPCR 判斷基因高低表達水平采用2-ΔΔCT法，2-ΔΔCT值>1時判斷為高表達，2-ΔΔCT值<1判斷為低表達。

1.5 統計分析

應用SPSS 26.0 軟件進行統計分析，結果以表示。配對t檢驗分析miR-101 基因簇在食管癌及其癌旁組織中的表達，以α=0.05為檢驗水準。Logistic回歸分析miR-101基因簇與食管癌發病風險的關系。采用受試者特征曲線(receiver operator characteristics curve，ROC)評價miR-101 基因簇對食管癌的診斷效力，通過計算曲線下面積(area under curve，AUC)來判斷診斷價值，Fisher 檢驗分析基因簇各miRNA 的表達和食管癌患者臨床病理指標之間的相關性。

2 結果

2.1 食管癌相關差異化表達的miRNA 篩選及miR-101基因簇表達水平TCGA數據庫驗證

對3 例新發食管鱗癌患者的食管癌組織及其癌旁組織進行miRNA 芯片高通量檢測。結果顯示288 種miRNAs在兩種組織中表達有差異，其中在食管鱗癌組織中有179種miRNAs表達下調。miR-101基因簇相關基因在食管癌組織中下調倍數(fold change)分別為hasmiR-101-3p(-11.90)、has-miR-125a-5p(-4.76)、hasmiR-127-5p(-4.35)、has-miR-145-5p(-2.17)，見 圖1。TCGA數據庫驗證miR-101基因簇相關基因表達水平，其中TCGA數據庫162例食管癌和正常食管組織樣本11例測序數據生物信息學分析結果顯示，與食管正常組織相比，miR-101-3p、miR-125a-5p和miR-145-5p在食管癌組織中表達均顯著下調(P<0.05)，見圖2。

圖1 食管癌及其癌旁組織中表達下調的部分miRNAs

圖2 TCGA數據庫中miR-101基因簇的表達水平

2.2 miR-101基因簇在食管癌患者中的表達水平

應用qPCR檢測miR-101基因簇在33例人群食管癌組織及其癌旁組織中的表達，結果顯示，miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p和miR-145-5p在食管癌患者癌組織中均呈低表達(P<0.05)，見表2。結果與芯片高通量測序及TCGA數據庫生物信息學分析相符。

2.3 miR-101基因簇與食管癌發病風險的分析

Logistic 回歸分析食管癌組織與癌旁組織中miR-101 基因簇各miRNA 的△CT值與食管癌發病風險之間的相關性，見表3。多因素logistic 回歸分析結果提示，miR-101-3p、miR-127-5p和miR-145-5p的表達水平與食管癌的發病風險呈負相關，增加其表達可以顯著降低食管癌的發病風險(均為P<0.05)。

表3 miR-101基因簇表達與食管癌發病相關性的logistic回歸分析(n=33)

2.4 miR-101基因簇對食管癌的診斷效力

采用ROC特征曲線法評價miR-101基因簇對食管癌的診斷效力，并通過計算AUC來確定食管癌的診斷價值。結果顯示，miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p 和miR-145-5p 診斷的AUC 分別為0.753、0.792、0.763 和0.800(P<0.05)，提示miR-101 基因簇在食管癌的診斷中具有一定診斷效力(圖3)。

圖3 miR-101基因簇對食管癌的診斷效力

2.5 miR-101 基因簇的表達與食管癌臨床病理指標的相關性分析

對miR-101基因簇中4個基因的表達水平與33例食管癌患者的臨床病理資料進行相關性分析。結果表明，miR-101-3p、miR-145-5p 的表達水平與腫瘤大小相關(P<0.05)，miR-125a-5p的表達水平與是否存在淋巴結轉移相關(P<0.05)，其他指標之間差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 miR-101基因簇表達水平與33例食管癌患者臨床病理指標的相關性分析

3 討論

食管癌作為惡性程度較高的消化道腫瘤之一，其病理類型中90%屬食管鱗狀細胞癌，中晚期的食管癌預后差且死亡率高[8]。目前，食管癌診斷主要依賴于內鏡活檢后的病理形態學觀察，但其漏診率大于30%[9]，在實驗室診斷方面尚缺乏特異性分子診斷標志物。探尋能夠準確反映食管癌癌變機制并能應用于食管癌高危人群早期診斷的生物標志是當前食管癌防治的重點。因此，本研究在食管癌芯片高通量檢測的基礎上，應用TCGA數據挖掘比對以及qPCR驗證的方式研究了miR-101基因簇與食管癌發病風險的關聯及其作為食管癌診斷生物標志物的可能性。

miRNA基因簇是由兩個或多個相關的miRNA基因組成，并在染色體上成簇排列形成的基因群，這些基因可通過綜合調控編碼基因并在多個層面上參與個體發育、代謝過程和疾病發生的調控[10]，可作為潛在的綜合性腫瘤診斷或預后判定標志。研究發現，與正常食管黏膜上皮組織比較，食管癌組織呈現不同的miRNA 表達模式[11]，其異常表達可為食管癌診斷和預后生物標志的探尋提供新的方向。

miR-101 具有兩個前體發夾結構，在人類中分別在1 號和9 號染色體轉錄而成，其臨近位置成簇排列miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p 和miR-145-5p。其中，miR-101-3p在食管癌[12]、肝癌[13]和子宮內膜癌[14]中呈低表達，發揮類似抑癌基因的作用。miR-125a-5p 在食管癌[15]和膀胱癌[16]細胞中呈低表達，發揮抑癌基因的作用。miR-127-5p 和miR-145-5p 在食管癌[17-18]、胃癌[19-20]和結腸癌[21]中呈低表達，也發揮抑癌基因的作用。為進一步研究miR-101基因簇的表達與食管癌之間的關系，確認芯片結果的準確性，本研究檢測了miR-101基因簇在33例食管癌及癌旁組織的表達水平。結果顯示miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p 和miR-145-5p 在食管癌組織中表達均為低表達，結果與TCGA數據庫結果相一致(miR-127-5p除外)。

同時，我們分析了miR-101基因簇與食管癌發病風險之間的關系，發現增加miR-101基因簇的表達可以降低食管癌的發病風險，臨床病理相關性分析結果提示miR-101-3p、miR-145-5p 的表達水平與食管癌患者腫瘤大小相關，miR-125a-5p 的表達水平與淋巴結轉移相關。表明miR-101-3p、miR-145-5p和miR-125a-5p 參與了食管癌的發生和發展，在食管癌進程中可能發揮重要功能，提示其可作為食管癌的潛在生物標志物。但本研究樣本的收集時間為1 年，所獲得的樣本量較小，可能不能完全代表整體水平。本研究33 例樣本中發現miR-127-5p 在食管癌患者癌組織中呈低表達與TCGA 數據庫結果不完全一致，這可能與樣本量較小有關，在接下來工作中我們擬收集更大樣本量進行驗證。

綜上所述，本研究分析和檢測了miR-101基因簇在食管癌中的表達情況，miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p和miR-145-5p的表達水平與食管癌的發病風險呈負相關，且miR-101-3p、miR-145-5p和miR-125a-5p的表達與食管癌患者的臨床病理因素具有相關性，提示miR-101基因簇在食管癌生物標志研究方面具有深入研究的價值。然而，miR-101 基因簇的各基因是否作為一個整體，參與復雜的分子信號調控網絡，共同影響食管癌的發生發展仍不清楚，其調控食管癌的分子機制有待于進一步研究。