耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌耐藥表型檢測(cè)的研究

黃小華,施 瑜

重慶市云陽(yáng)縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶 404500

肺炎克雷伯菌(KP)是一種革蘭陰性菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，在臨床中屬于常見(jiàn)的條件致病菌，感染KP時(shí)可引起血流感染、尿路感染、肺炎等[1-2]。近年來(lái)，碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物被廣泛應(yīng)用于臨床，由于不合理使用抗菌藥物的情況較多，導(dǎo)致KP對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物的耐藥性逐漸增加[3]。當(dāng)感染KP時(shí)，患者體內(nèi)的菌株清除難度較大，這不僅會(huì)延長(zhǎng)患者的住院治療時(shí)間，還會(huì)給其生命安全構(gòu)成極大威脅。因此，為了有效治療KP感染，治療前必須深入分析患者感染KP的耐藥性，以合理選擇抗菌藥物。本研究為了進(jìn)一步了解耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌(CRKP)耐藥表型檢測(cè)的價(jià)值，對(duì)2018-2021年本院分離的450株KP進(jìn)行了臨床分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 對(duì)2018—2021年本院分離的450株KP進(jìn)行分析，以同一患者相同細(xì)菌保留檢出的第1株為原則剔除重復(fù)菌株。收集記錄KP菌株對(duì)應(yīng)的標(biāo)本類(lèi)型、標(biāo)本收集日期，以及患者的性別、年齡、臨床科室、出入院日期。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌鑒定 采用MicroScan WalkAway 96全自動(dòng)微生物鑒定儀對(duì)450株細(xì)菌進(jìn)行細(xì)菌種屬鑒定。

1.2.2KP耐藥表型確證 采用改良Hodge試驗(yàn)行產(chǎn)碳青霉烯酶表型確證，將大腸埃希菌ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)菌株配制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海S后采用生理鹽水按1∶10將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙合♂專♂尯笸坑贛H瓊脂平板上，于平板中間貼上相應(yīng)的藥敏試紙。分別挑取血平板上過(guò)夜培養(yǎng)的陽(yáng)性質(zhì)控菌株、陰性質(zhì)控菌株和待檢菌株，數(shù)量均為3～5個(gè)，在平板邊緣向中心劃線并接種，于35 ℃環(huán)境下培養(yǎng)20 h，若菌線周?chē)?xì)菌呈矢狀生長(zhǎng)，則證實(shí)該菌株產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.2.3產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶確證試驗(yàn) 將KP用生理鹽水配制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海槿∵m量菌懸液涂于MH瓊脂平板，采用頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟/克拉維酸藥敏試紙進(jìn)行檢測(cè)，于35 ℃環(huán)境下培養(yǎng)20 h，任意藥敏試紙和復(fù)合藥敏試紙的抑菌直徑差距≥5 mm，則表示該菌產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶。

1.2.4AmpC酶檢測(cè) 采用紙片擴(kuò)散(K-B)法，將頭孢西丁耐藥(抑菌圈直徑≤17 mm)、頭孢噻肟耐藥(抑菌圈直徑≤22 mm)定為疑似產(chǎn)AmpC酶，隨后進(jìn)行改良三維試驗(yàn)。首先，抽取過(guò)夜培養(yǎng)的純分離菌落，并接種至5 mL的滅菌肉湯(LB)培養(yǎng)基中，于35 ℃孵育箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)后以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速對(duì)標(biāo)本進(jìn)行20 min離心處理，留取上清液，沉淀后放入—20 ℃冰箱中反復(fù)凍融8次，再次以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，獲取的上清液則為酶粗提取物。將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c埃希菌ATCC25922接種于MH瓊脂平板上，將FOX紙片貼于平板中間，采用滅菌刀片從紙片邊緣5 mm處向外切寬為1 mm的夾縫，抽取40 μL細(xì)菌酶粗提取物并加入夾縫中，于35 ℃孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。若該菌株沿夾縫呈箭頭樣向內(nèi)生長(zhǎng)，則表示該菌產(chǎn)AmpC酶。

1.2.5藥敏試驗(yàn) 主要選取替加環(huán)素、美羅培南、亞胺培南等抗菌藥物進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)確定藥物的敏感、中介、耐藥。

1.2.6多位點(diǎn)序列分型(MLST)檢測(cè) MLST 根據(jù)Institute Pasteur MLST and Whole Genome MLST Database(http：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/)分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增KP 7個(gè)管家基因(rpoB、phoE、gapA、infB、mdh、tonB和pgi)。擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣州華大基因公司測(cè)序，基因序列上傳至Institute Pasteur MLST and Whole Genome MLST Database，獲得相應(yīng)的等位基因編號(hào)，進(jìn)而檢索出菌株的序列分型(ST)。

1.3觀察指標(biāo) (1)觀察450株KP的標(biāo)本來(lái)源類(lèi)型；(2)觀察450株KP中CRKP與碳青霉烯類(lèi)敏感肺炎克雷伯菌(CSKP)對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥的情況；(3)觀察CRKP主要耐藥表型對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥情況；(4)觀察主要耐藥表型CRKP來(lái)源患者的性別、年齡、住院時(shí)間、標(biāo)本類(lèi)型、臨床科室分布情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用世界衛(wèi)生組織(WHO)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)提供的WHONET5.6軟件進(jìn)行細(xì)菌耐藥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，藥敏結(jié)果及耐藥表型分布情況采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1KP的標(biāo)本來(lái)源 450株KP主要來(lái)自痰液(45.6%)、分泌物(17.6%)、尿液(15.1%)、血液(8.4%)標(biāo)本。見(jiàn)表1。

表1 KP的標(biāo)本來(lái)源

2.2KP的耐藥檢測(cè)結(jié)果 450株KP對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南的耐藥率分別為6.00%、6.00%、7.78%；其中CRKP共36株，占8.00%，產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶菌株共83株，占18.4%，產(chǎn)AmpC酶菌株共29株，占6.4%。CRKP對(duì)替加環(huán)素、阿米卡星等23種抗菌藥物的耐藥率均高于CSKP菌株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表2。

2.3CRKP耐藥表型 MLST檢測(cè)結(jié)果顯示，36株 CRKP中有11株為ST11型，占30.56%；7株為ST2305型，占19.44%；5株為ST2390型，占13.89%；2株為ST736型，2株為ST20型，而ST23型、ST25型、ST34型、ST147型、ST441型、ST629型、ST1224型、ST2236型、ST2389型各1株。

2.3.1不同耐藥表型CRKP對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥情況 常見(jiàn)的ST11型、ST2305型、ST2390型菌株對(duì)替加環(huán)素的耐藥率較低，但對(duì)臨床其他常用抗菌藥物的耐藥率均較高，3種常見(jiàn)耐藥表型CRKP菌株的耐藥率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

2.3.2不同耐藥表型CRKP的分布情況 常見(jiàn)的ST11型、ST2305型、ST2390型菌株來(lái)源患者性別比例較一致，以≥15歲人群為主，住院時(shí)間多≥31 d，痰液、分泌物標(biāo)本培養(yǎng)出來(lái)居多，主要分布于ICU、肺病科、老年病科，此3種耐藥表型CRKP在各項(xiàng)分布上比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而其他型CRKP在性別上的比例也較一致，以老年人(≥65歲人群)為主，住院時(shí)間多≥31 d，痰液標(biāo)本培養(yǎng)出來(lái)居多，主要分布于ICU、老年病科。見(jiàn)表4。

表4 不同耐藥表型CRKP的分布情況[n(%)]

3 討 論

目前，細(xì)菌耐藥已成為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，及時(shí)發(fā)現(xiàn)、監(jiān)控醫(yī)院CRKP的定植感染對(duì)控制細(xì)菌耐藥、細(xì)菌傳播、保護(hù)患者生命安全具有重要意義。KP是腸桿菌科克雷伯菌屬中最為重要的一類(lèi)菌，呈桿狀，多以單獨(dú)、成雙或短鏈狀排列，有較厚的莢膜，多數(shù)有菌毛，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛，其所致疾病占克雷伯菌屬感染的90%以上[4]。KP主要分布于人體上呼吸道和腸道，當(dāng)人體免疫力下降時(shí)，該細(xì)菌會(huì)經(jīng)由呼吸道入侵肺部，引起感染。在醫(yī)院對(duì)標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌鑒定時(shí)，KP較為常見(jiàn)。本研究結(jié)果表明，本院分離的450株KP主要來(lái)自痰液(45.6%)、分泌物(17.6%)、尿液(15.1%)、血液(8.4%)。凌峰等[5]研究同樣發(fā)現(xiàn)KP主要來(lái)源于痰液標(biāo)本(73.91%)。然而，對(duì)于感染KP的患者，臨床必須為其合理選擇抗菌藥物，以提高細(xì)菌清除率，改善患者預(yù)后。

在所有非典型β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物中，碳青霉烯類(lèi)藥物的抗菌譜最廣，抗菌活性最強(qiáng)，且毒性低，該類(lèi)藥物在細(xì)菌感染治療中發(fā)揮著重要作用[6-7]。近年來(lái)，隨著碳青霉烯類(lèi)藥物的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，細(xì)菌耐碳青霉烯類(lèi)藥物的問(wèn)題也日益突顯。碳青霉烯酶一般分為A、B、D 3種類(lèi)型，其中A類(lèi)為絲氨酸酶，B類(lèi)為金屬β-內(nèi)酰胺酶，D類(lèi)為苯唑西林酶[8-9]。為了了解細(xì)菌耐碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的情況，諸多學(xué)者開(kāi)展了相關(guān)研究探索。楊燕文等[10]研究指出，29株KP中共有20株(占68.97%)檢測(cè)到碳青霉烯酶基因，其中KPC檢出率為17.24%(5/29)，IMP檢出率為13.79%(4/29)，NDM檢出率為37.93%(11/29)，該研究認(rèn)為KPC-2、NDM-1是碳青霉烯酶的主要耐藥基因型。在本研究中，450株KP對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南的耐藥率分別為6.00%、6.00%、7.78%。該結(jié)果提示，KP對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物有一定耐藥性，但對(duì)美羅培南、亞胺培南、厄他培南等藥物的耐藥性相對(duì)較低，這一結(jié)果與徐婭雯等[11]研究結(jié)果相似。然而，值得注意的是碳青霉烯酶中的金屬酶水解活性相對(duì)較弱，進(jìn)行導(dǎo)致藥敏試驗(yàn)時(shí)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)可出現(xiàn)升高情況，但仍然未達(dá)到耐藥折點(diǎn)，甚至可表現(xiàn)為敏感[12-13]，這也導(dǎo)致耐藥基因出現(xiàn)傳播且未被注意到。不過(guò)本研究結(jié)果顯示，CRKP對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑和呋喃妥因的耐藥率分別為61.11%、66.67%，對(duì)替加環(huán)素的耐藥率僅為13.89%，這提示四環(huán)素類(lèi)、硝基呋喃類(lèi)及磺胺類(lèi)等抗菌藥物可作為治療CRKP感染的選擇藥物。因此，在治療早期，醫(yī)師可以選擇CRKP敏感的藥物進(jìn)行抗感染治療，尤其是替加環(huán)素，之后可以根據(jù)細(xì)菌藥敏鑒定結(jié)果，進(jìn)一步選擇敏感、安全的抗菌藥物。

一直以來(lái)臨床認(rèn)為碳青霉烯類(lèi)藥物是治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶KP感染的有效抗菌藥物，但是超廣譜-β內(nèi)酰胺酶、AmpC酶的產(chǎn)生與膜孔蛋白改變等耐藥機(jī)制合并出現(xiàn)時(shí)，會(huì)進(jìn)一步增加KP的MIC值，此時(shí)KP則對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥，極易導(dǎo)致感染的暴發(fā)流行。本研究結(jié)果也顯示，36株CRKP菌株中，產(chǎn)超廣譜-β內(nèi)酰胺酶菌株及產(chǎn)AmpC酶菌株比例非常高。因此，對(duì)本地區(qū)CRKP感染的流行病學(xué)特征進(jìn)行探討尤為重要。本研究中耐藥表型分析顯示，36株 CRKP中有11株ST11型(30.56%)、7株ST2305型(19.44%)、5株為ST2390型(13.89%)，其他多種表型菌株占比小。本研究結(jié)果還顯示，3種優(yōu)勢(shì)菌株對(duì)替加環(huán)素的耐藥率較低，但對(duì)喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物的耐藥率均在50%以上。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)這3年以來(lái)，出現(xiàn)了少量新的ST型菌株。因此，臨床上在監(jiān)測(cè)主要優(yōu)勢(shì)菌株流行的同時(shí)，也要關(guān)注一些散發(fā)的ST型。36株CRKP主要來(lái)源于≥15歲人群，住院時(shí)間較長(zhǎng)，痰液標(biāo)本培養(yǎng)出來(lái)居多，主要分布于ICU、肺病科、老年病科。ICU、老年病科收治的患者病情較嚴(yán)重，且患者年齡大，基礎(chǔ)疾病多，機(jī)體免疫力低下，大多數(shù)患者接受過(guò)侵入性操作，醫(yī)院獲得性感染的發(fā)生率更高，感染CRKP后，又會(huì)導(dǎo)致住院時(shí)間明顯延長(zhǎng)。呼吸道傳播是CRKP最常見(jiàn)的傳播途徑，而肺病科收治的患者以呼吸系統(tǒng)疾病為主，患者更易發(fā)生醫(yī)院獲得性呼吸道感染。同時(shí)，ICU、老年病科、肺病科的患者抗菌藥物使用較多，且住院時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，這也是同源性KP分布較多的原因。雖然目前CRKP同源性分析沒(méi)有一個(gè)明確的標(biāo)準(zhǔn)，但從各耐藥表型的比例可看出，本院CRKP菌株的同源性相對(duì)值比較低，證實(shí)臨床科室針對(duì)CRKP感染做好了手衛(wèi)生、環(huán)境消毒等工作，避免了CRKP進(jìn)一步的播散流行，真正做到了早發(fā)現(xiàn)，早隔離，早治療。同時(shí)，本院院感科重視CRKP的檢出，認(rèn)真查對(duì)檢出CRKP的臨床科室、患者資料及標(biāo)本送檢情況，并對(duì)臨床科室進(jìn)行環(huán)境物體表面采樣，積極尋找傳染源。實(shí)驗(yàn)室也能及時(shí)和臨床科室溝通，對(duì)合格標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，提高了CRKP菌株的檢出率。

綜上所述，耐藥表型檢測(cè)能較好地反映本院CRKP局部流行的態(tài)勢(shì)，也能了解菌株發(fā)生變異的情況，如結(jié)合常規(guī)藥敏試驗(yàn)，可有效預(yù)防和控制CRKP的播散。