NCX-4016通過下調終末化糖基產物受體表達抑制高糖內環境誘導的動脈粥樣硬化

寇 進，尹 銳，任 鋒△

1.武警陜西省總隊醫院心血管內科，陜西西安 710054；2.成都醫學院第二附屬醫院心血管內科，四川成都 610057

近年來，我國冠心病發病率快速增長[1]。目前，盡管臨床上對冠心病采取了有效的二級預防及介入治療措施，但其發病率及病死率在西方國家仍居高不下[1]。動脈粥樣硬化是一種由脂代謝異常和血管壁斑塊脂質沉積介導的慢性炎癥性疾病[2]。近年來，終末化糖基產物受體(RAGE)作為天然免疫中的一種模式識別受體，其在動脈粥樣硬化進程中的作用及機制已被廣泛深入地研究，已被證實不僅參與了動脈粥樣硬化的早期形成，也促進了晚期斑塊的進展[2-3]。研究發現，通過基因敲除或給予競爭性拮抗劑等方法降低RAGE表達，可明顯抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，并穩定晚期斑塊[4]，這說明RAGE是防治動脈粥樣硬化的潛在關鍵靶點。內皮功能不全常常與動脈粥樣硬化合并發生，既是冠狀動脈粥樣硬化的起始階段，也是血管壁炎性反應激活狀態下血管內皮細胞的損傷性反應[5]。一氧化氮(NO)作為一種重要的血管舒張因子，通過鳥苷酸環化酶途徑促進環磷酸鳥苷(cGMP)的生成，其減少將抑制cGMP形成，導致血管收縮，進一步加重血管內皮功能障礙。因此，NO是一種抗動脈粥樣硬化和抗血栓形成的內源性物質[6]。有學者在動物實驗中已經發現NO供體藥物NCX-4016對脂多糖(LPS)介導的大鼠內毒素血癥具有明顯的抗炎作用，但沒有對其是否可以明顯抑制或逆轉動脈粥樣硬化斑塊的形成做出解答[7]。從機制上來說，雖然目前已有研究發現在慢性腎臟病和糖尿病腎病患者中，AGEs/RAGE通路通過抑制內皮型一氧化氮合酶 (eNOS)，影響內源性NO的產生，從而使正常的抗炎和細胞保護效應喪失。但是否存在RAGE-eNOS的正反饋環路，即外源性補充NO分子是否能夠通過抑制RAGE介導的固有免疫炎癥通路同時促進下游eNOS表達的增加，從而發揮抗炎和抗動脈粥樣硬化作用仍然不得而知[8-9]。因此，本研究提出了NO可以直接影響血管RAGE表達水平，發揮抗炎作用，進而抑制動脈粥樣硬化進程的假設，希望證實并闡明NO對動脈粥樣硬化及損傷內皮細胞中RAGE表達的調節作用及機制，為動脈粥樣硬化的防治提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1動物來源 2型糖尿病動脈粥樣硬化模型小鼠為apoE-/-小鼠和db/db小鼠模型雜交鼠10只，購自南京大學模式動物研究所，給予高脂飲食喂養誘導動脈粥樣硬化模型，分為實驗組和對照組，每組5只。實驗組根據小鼠體質量，給予5 mg/g尾靜脈注射NCX-4016，2 d 1次，持續4周。對照組給予等量生理鹽水注射，2 d 1次，持續4周。

1.2主要試劑 人臍靜脈內皮細胞系(hUVECs)購自上海復祥生物科技有限公司。NO供體藥物NCX-4016由紐約大學STEFANO FIORUCCI教授實驗室饋贈，RAGE、白細胞介素(IL)-1β、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、核轉錄因子-κB(NF-κB)p65、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等抗體均購自Abcam公司(美國)。PKG抑制劑TK5823購自碧云天生物技術有限公司。小鼠血清可溶性晚期糖基化終末產物受體(sRAGE)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自默沙克生物科技有限公司。 晚期糖基化終末分化產物標準品AGE-BSA購自BioVision(丹麥)生物科技有限公司。

1.3ELISA檢測sRAGE水平 給予兩組小鼠相應處理4周后，采集小鼠血液標本。按照ELISA檢測試劑盒說明書對小鼠血清sRAGE水平進行檢測，利用標準品設立標準曲線后，采用雙抗夾心法標記生物素，加入辣根過氧化物酶結合物工作液，37 ℃孵育30 min，加入TMB顯色試劑進行顯色反應后立即在酶標儀上測量吸光度(A)值，根據A值在標準曲線上求出相應的血清sRAGE水平。

1.4主動脈根部油紅，染色和斑塊面積評估 在分別給予實驗組NCX-4016治療和對照組生理鹽水注射4周后，處死兩組小鼠，暴露胸腔，切除心臟，取主動脈根部組織包埋于—20 ℃ OCT包埋劑中，從心底朝主動脈開口方向連續切片，自出現主動脈瓣膜開始，每隔80 μm取一張切片，連續取6張貼于同一載玻片上，切片于—80 ℃冰箱中保存。主動脈根部粥樣硬化斑塊油紅染色步驟如下：(1)冰凍切片取出后室溫干燥1 h；(2)4%中性甲醛溶液固定10 min，去離子水洗2次，每次5 min；(3)60%異丙醇洗30 s；(4)油紅O染液染色18 min；(5)60%異丙醇洗30 s，去離子水洗2次，每次5 min；(6)蘇木素染液染核10 min；(7)自來水沖洗5 min，去離子水洗5 min；(8)亮綠染液染4 min，去離子水洗1 min；(9)干燥后純甘油封片；(10)Leica光學顯微鏡下觀察并拍照后，采用Image Pro Plus圖像軟件計算斑塊面積。

1.5免疫組化染色 為了觀察動脈粥樣硬化斑塊內RAGE表達情況，采用免疫熒光染色法檢測主動脈根部組織冰凍切片中RAGE相對表達水平及部位，步驟如下：(1)主動脈根部組織冰凍切片取出后室溫干燥1 h；(2)4%中性甲醛溶液固定10 min，去離子水洗2次，每次5 min；(3)5%山羊血清封閉1 h；(4)加一抗4 ℃孵育過夜；(5)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5 min，加紅色熒光二抗(1∶500)室溫孵育1 h；(6)PBS洗3次，每次5 min，加DAPI(1 μg/mL)染核10 min；(7)PBS洗3次，每次5 min，并采用純甘油封片；(8)Leica熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Ipp6.0圖像軟件進行灰度值計算。

1.6細胞培養及處理 hUVECs于25 mmol/L DMEM高糖培養基中加20%胎牛血清混合后分別培養，加1%鏈青霉素防止細胞污染。傳代兩次且待細胞融合度至80%左右，加入1 μg/mL LPS誘導炎癥損傷反應6 h后，分為4組，按如下方法進行不同干預：(1)PBS處理組采用PBS進行處理；(2)NCX-4016組采用5 μmol/L NCX-4016 進行處理；(3)eNOS抑制劑+NCX-4016組采用100 μmol/L eNOS抑制劑，5 μmol/L NCX-4016進行處理；(4)PKG抑制劑+NCX-4016組采用1 μmol/L KT5823和5 μmol/L NCX-4016進行處理。所有細胞實驗均進行3次獨立重復實驗。

1.7Western blot法檢測 采用Western blot法檢測兩組小鼠主動脈根部組織和hUVECs中RAGE、NF-κB p65、eNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α等相對表達水平。采用RIPA裂解液提取血管組織總蛋白，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度后將相同質量蛋白上樣至10% SDS-PAGE分離膠中，按60 V 40 min，90 V 150 min的條件進行蛋白電泳，電泳完成后利用濕轉儀，以350 mA、120 min的條件將蛋白濕轉至PVDF膜上，以5%BSA封閉液將PVDF膜室溫孵育1 h，按最佳濃度配制一抗工作液進行一抗孵育，4 ℃過夜。棄去一抗工作液，用TBST洗膜3次，每次10 min后，按1∶4 000比例加入相應二抗，室溫孵育1 h。棄去二抗工作液，用TBST洗膜3次，每次10 min，取出PVDF膜并用吸水紙吸取膜表面水分，將其浸入ECL工作液中(A及B液等體積混勻即可)，室溫孵育2 min后曝光，采用QUANTITY ONE軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin作為內參計算蛋白質相對表達量。

2 結 果

2.1對照組與實驗組主動脈根部斑塊面積的比較 對照組小鼠主動脈根部動脈粥樣硬化斑塊面積明顯大于實驗組，見圖1。對照組和實驗組小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積占主動脈根部面積比分別為(25.62±3.34)%、(37.43±3.56)%，差異有統計學意義(P<0.05)。

注：A為對照組；B為實驗組。圖1 兩組小鼠主動脈根部油紅染色圖

2.2對照組與實驗組主動脈根部斑塊組織內RAGE、炎癥信號通路蛋白和炎癥因子水平比較 Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，實驗組小鼠主動脈根部RAGE及其下游炎癥信號通路蛋白和炎癥因子相對表達水平明顯降低，見圖2A。與對照組比較，實驗組主動脈根部斑塊組織內RAGE和NF-κB p65相對表達水平明顯減少，eNOS相對表達水平增加，差異均有統計學意義(P<0.05)；兩組HMGB1蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2B。同時，與對照組比較，實驗組TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯減少，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2C。

注：A為各項指標Western blot檢測結果；B為對照組與實驗組主動脈根部斑塊組織內RAGE、炎癥信號通路蛋白比較；C為對照組與實驗組主動脈根部斑塊組織內炎癥因子比較；與對照組比較，*P<0.05。圖2 對照組與實驗組主動脈根部組織RAGE、炎癥信號通路蛋白和炎癥因子水平比較

2.3糖尿病動脈粥樣硬化小鼠的sRAGE血清學水平 ELISA檢測結果顯示，實驗組與對照組血清sRAGE水平分別為(2.82±0.19)、(2.44±0.20)ng/mL，兩組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4NCX-4016處理對高糖刺激聯合LPS誘導后的hUVECs的細胞炎癥信號通路蛋白、炎癥因子表達水平的影響 與PBS處理組比較，NCX-4016組中，NCX-4016處理接受高糖刺激及LPS誘導的hUVECs后，采用Western bolt法檢測細胞炎癥信號通路蛋白和炎癥因子的表達情況，其中HMGB1表達無明顯改變(P>0.05),RAGE及NF-κB p65表達明顯降低(P<0.05，圖3)，炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達明顯降低(P<0.05，圖4)。 與NCX-4016組比較，eNOS抑制劑+NCX-4016組IL-6表達水平無明顯改變(P>0.05)，但NF-κB p65、RAGE、IL-1β、TNF-α表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖5、6)。與NCX-4016組比較，PKG抑制劑+NCX-4016組NF-κB p65、IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05，圖5、6)。

圖3 不同體外干預方式處理hUVECs后炎癥通路蛋白的Western blot檢測結果

圖4 不同體外干預方式處理hUVECs后炎癥因子的Western blot檢測結果

注：與NCX-4016組比較，*P<0.05。圖5 不同體外干預方式處理hUVECs后炎癥因子水平比較

注：與NCX-4016組比較，*P<0.05。圖6 不同體外干預方式處理hUVECs后炎癥通路蛋白水平比較

3 討 論

近年來RAGE在動脈粥樣硬化進程中的作用引發了極大關注。RAGE可與HMGB1、晚期糖基化終末產物(AGEs)、S100/鈣顆粒素、β-淀粉樣蛋白及兩性蛋白多個配體結合，從而活化P38、NF-κB等信號通路，進而上調細胞間黏附分子1、血管細胞黏附分子1及TNF-α等炎癥因子水平[10-11]。在糖尿病致動脈粥樣硬化斑塊形成和進展的過程中，內源性生成增加的AGEs通過與其在炎癥細胞和內皮細胞上的RAGE相結合，激活炎癥通路并釋放炎癥因子，這些炎癥因子可活化單核/巨噬細胞等炎癥細胞，促進其黏附、浸潤至血管內膜下，進一步促進局部炎性反應及動脈粥樣硬化的發生、發展[8-9]。已有研究證實，RAGE與apoE基因雙敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊面積明顯低于apoE-/-小鼠，同時，采用sRAGE對apoE-/-小鼠進行干預，通過其競爭性抑制RAGE的作用可以明顯抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成及晚期斑塊的進展[12]。此外，臨床研究發現低血漿sRAGE水平與非糖尿病男性冠心病心血管事件發生相關[13]。這些研究提示RAGE在動脈粥樣硬化的進展中起了關鍵作用。因此，闡明動脈粥樣硬化中RAGE的表達機制，從而探索調節RAGE水平的方法已成為防治動脈粥樣硬化的一條可行途徑。

RAGE有組成型和誘導型兩種，組成型RAGE主要表達于胚胎發育時期，成年后除肺與皮膚外，其他組織、細胞表達均下調,而誘導型RAGE在單核/巨噬細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞內正常生理條件下表達很低，只有在RAGE的配體增多或者其轉錄因子(包括SP-1與NF-κB)活化時，誘導型RAGE才表達增多[14-15]。RAGE還可分為細胞表面的膜RAGE和sRAGE，前者為AGEs的模式識別受體，激活后可以介導炎性反應，后者為可溶性分子形式，由RAGE的mRNA剪接演變而來，可以在循環血中捕獲AGEs，競爭性拮抗經典性受體控制的炎癥信號通路。RAGE信號通路激活后可介導活性氧(ROS)，活化下游NF-κB，促進炎性反應的發展，而炎癥細胞可直接釋放HMGB1與S100/鈣顆粒素，這些因子均可誘導RAGE表達增加[14，16]。本研究發現，對照組的apoE-/-小鼠和db/db小鼠模型雜交鼠主動脈內膜上已有明顯的炎癥細胞黏附、浸潤，表明本研究處理之前已經發生了內皮功能不全；同時，對照組apoE-/-小鼠和db/db小鼠模型雜交鼠主動脈根部斑塊組織內的RAGE表達明顯升高。故內皮功能不全可能參與了RAGE的表達調節。

內皮功能不全以內皮源性NO減少為主要特點，通過減少內皮源性NO、增加ROS水平、上調內皮細胞表面黏附分子、增加內皮細胞通透性、促進炎癥細胞黏附浸潤等促進動脈粥樣硬化的發生、發展，是動脈粥樣硬化的起始階段[17]。NO供體藥物已經被證實可以在動物模型中抑制LPS介導的內毒素血癥和炎性反應。NO供體及其他改善內皮功能不全的藥物(如他汀類藥物)均可通過抗炎效應抑制動脈粥樣硬化的進程[18]。近年來，研究發現他汀類及血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)類藥物可抑制動脈粥樣硬化斑塊中RAGE的表達，且對RAGE的抑制作用在此類藥物改善動脈粥樣硬化中發揮了重要作用，說明RAGE作為一種重要的炎癥信號通路在冠狀動脈粥樣硬化形成中具有重要意義[19-20]。本研究進一步研究發現，NO供體藥物抑制了具有2型糖尿病背景的模型小鼠動脈粥樣硬化的進展，同時也降低了血管中RAGE的蛋白表達，但不影響RAGE上游的HMGB1。此外NO供體藥物可以通過抑制RAGE表達，減輕RAGE對eNOS表達的負調控作用，促進eNOS表達增加，從而產生NO內源性合成的正反饋效應。而上述作用在體外誘導hUVECs實驗中均被NO抑制劑和PKG抑制劑所逆轉。NO供體藥物可以通過抑制RAGE表達，減輕RAGE對eNOS表達的負調控作用，促進eNOS表達增加，從而產生NO內源性合成的正反饋效應[21]。另外，本研究還發現NCX-4016抑制RAGE蛋白表達的同時，并未增加血清sRAGE水平，說明NO供體藥物和外源性NO通過直接抑制RAGE的轉錄而非其他轉錄后調控機制(RNA剪接)發揮抗炎作用。此外本研究發現與抑制eNOS相比，直接抑制PKG信號通路，將會導致IL-1β的表達更加明顯增加，且二者差異有統計學意義(P<0.05)，說明抑制PKG信號通路將會更明顯地抑制NCX-4016的抗炎保護作用。可能原因為NCX-4016作為NO供體，增加了外源性NO的補充，從而部分抵消了eNOS抑制所導致的NO生成不足，而PKG抑制劑則直接抑制了NO的下游信號途徑，導致NO失能，因此更加徹底地消除了NO的抗炎效應。

綜上所述，本研究發現了NCX-4016可以作為NO供體藥物在2型糖尿病動脈粥樣硬化模型小鼠中發揮動脈粥樣硬化保護作用。外源性NO分子可以作為上游信號分子，以cGMP/PKG依賴的途徑負調控RAGE的轉錄和表達，同時抑制RAGE下游對于eNOS表達的負性作用，形成內源性NO分子的正反饋環路，最終發揮抗炎抗動脈粥樣硬化作用。該研究進一步明確了NO在抗炎和抗動脈粥樣硬化中的重要作用，說明了NO可以依賴于cGMP/PKG途徑同時發揮舒血管作用與抗炎作用，在糖尿病動脈粥樣硬化模型中抑制血管壁RAGE的表達發揮保護作用，為RAGE作為靶點的抗動脈粥樣硬化治療提供了理論基礎。