CRE耐藥基因的流行情況與耐藥情況*

汪一萍，倪劍鋒，魯 勇，應建飛，蔣 磊，史俊穎

1.寧波大學附屬人民醫院檢驗科，浙江寧波 315105；2.寧波基內生物技術有限公司，浙江寧波 315200

碳青霉烯類抗菌藥物一直是產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)或AmpC酶的腸桿菌科細菌治療首選藥物[1-2]。隨著此類抗菌藥物的廣泛使用，臨床耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率逐年升高，增加了臨床用藥的選擇難度[3-4]。產碳青霉烯酶是形成CRE菌株的主要耐藥機制，不同類型碳青霉烯酶具有不同的水解抗菌藥物活性，其耐藥譜也存在一定差異[5-6]。按照Ambler分子分類原則，編碼碳青霉烯酶的耐藥基因可分為A、B、D 3類[7]。本研究對2017—2020年臨床分離的CRE菌株進行藥敏試驗、耐藥基因鑒定，并對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)進行同源性分析，為CRE的耐藥檢測，以及預防和控制CRE的院內傳播提供實驗室依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2017—2020年寧波大學附屬人民醫院臨床分離的CRE 222株，作為對照的標準(或參考)菌株均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2儀器與試劑 所用儀器主要包括全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(法國生物梅里埃公司)、恒溫培養箱(上海恒一科學儀器有限公司)、熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、離心機及金屬浴(德國Eppendorf公司)。主要試劑包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌及3種碳青霉烯酶耐藥基因(NDM、KPC和OXA-48)檢測試劑盒(寧波基內生物技術有限公司)，美羅培南、亞胺培南、阿米卡星與環丙沙星等抗菌藥物(中國藥品生物制品檢定所)。本研究中引物的合成和擴增產物測序均由上海杰李生物技術有限公司完成。

1.3CRE菌株鑒定及藥敏試驗 222株CRE菌株均使用全自動細菌鑒定及藥敏分析系統進行鑒定，并對各種抗菌藥物的耐藥率進行數據分析。

1.4CRE菌株的基因檢測 (1)CRE菌株的熒光定量PCR檢測：以CRE菌株DNA為模板，分別對兩種常見細菌的基因進行檢測，包括大腸埃希菌的特異性基因(ydij)和肺炎克雷伯菌的特異性基因(phoE)中3種常見碳青霉烯酶耐藥基因(NDM、KPC和OXA-48)，反應體系為25 μL，包括6 μL DNA模板和19 μL PCR反應混合液。PCR反應條件為37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，循環1次；93 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環35次，單點熒光檢測溫度為60 ℃。熒光通道檢測選擇：ydij、KPC基因選用 FAM 通道，NDM、OXA-48 基因選用 ROX 通道，內標基因選用 JOE 通道。(2)基因測序：設計CRE常見碳青霉烯酶耐藥基因(NDM、KPC、OXA-48、IMP和VIM)引物進行測序[8]，將CRE菌株測序后所得的序列與GenBank核酸數據庫(NDM：JX104760；KPC：1i844849；OXA-48：NC_049454.1；IMP：JX104760；VIM：NG_022326.1)進行BLAST序列比對，見表1。

表1 耐藥基因測序引物

1.5CRKP的同源性分析 以CRKP菌株DNA為模板，參考多位點序列分析(MLST)官方網站(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella /klebsiella.html)上提供的肺炎克雷伯菌的7個管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB)序列合成引物，見表2；依次擴增CRKP菌株的這7個管家基因。PCR反應條件如下：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，循環35次；72 ℃，10 min。將CRKP菌株的7個管家基因PCR產物進行雙向測序。得到測序結果后分析CRKP菌株的親緣性關系，即進行同源性分析。

表2 肺炎克雷伯菌的7個管家基因引物序列

2 結 果

2.1菌株分布 在222株CRE中，細菌培養鑒定法檢出大腸埃希菌78株(35.1%)，肺炎克雷伯菌71株(32.0%)，陰溝腸桿菌28株(12.6%)，霍氏腸桿菌13株(5.9%)，費氏檸檬酸桿菌9株(4.1%)，植生拉烏爾菌8株(3.6%)，產氣腸桿菌6株(2.7%)，產酸克雷伯菌5株(2.3%)，解鳥氨酸拉烏爾菌3株(1.4%)，克氏檸檬酸桿菌1株(0.5%)。將熒光定量PCR鑒定+基因測序鑒定的結果與細菌培養鑒定結果進行對比，細菌培養鑒定為大腸埃希菌的78株中，測序鑒定76株符合細菌培養鑒定結果，另2株分別為產酸克雷伯菌與霍氏腸桿菌。細菌培養鑒定的符合率為97.4%。

2.2藥敏試驗結果 222株CRE菌株對大部分抗菌藥物的耐藥率都大于80.0%，對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、米諾環素具有較好的敏感性，見表3。

表3 222株CRE菌株對常用抗菌藥物的藥敏試驗結果

2.3熒光定量PCR與基因測序結果 222株CRE熒光定量PCR與基因測序同時檢出NDM基因陽性131株(59.0%)，熒光定量PCR檢出KPC基因陽性56株(24.3%)，基因測序檢出IMP基因陽性13株(5.9%)，VIM基因陽性僅有1株(0.5%)，OXA-48基因陽性僅1株(0.5%)，熒光定量PCR未檢出耐藥基因20株(9.0%)，見表4。通過熒光定量PCR檢測耐藥基因NDM、KPC、OXA-48的檢出率為84.7%；通過基因測序檢測耐藥基因NDM、KPC、OXA-48、IMP、VIM的檢出率為91.0%。將NDM、KPC和OXA-48基因的熒光定量PCR結果與基因測序結果進行分析，結果顯示NDM熒光定量PCR的陽性符合率為98.5%，陰性符合率為97.8%；KPC基因熒光定量PCR的陽性符合率為94.6%，陰性符合率為99.4%；OXA-48基因熒光定量PCR的陽性符合率為100.0%，陰性符合率為100.0%。

表4 CRE耐藥基因熒光定量PCR和耐藥基因測序結果(n)

2.4MLST結果 對49株CRKP的MLST結果顯示，ST11型最多為26株，其次為ST15型7株，ST2357型4株，ST1810型3株，ST278型2株，ST2388型2株，ST86型1株，ST347型1株，ST697型1株，ST1326型1株，ST2790型1株。

3 討 論

CRE往往對多種抗菌藥物嚴重耐藥，治療極其困難，已成為全球范圍的公共衛生問題[9]。本研究收集的222株CRE，檢出株數位居前兩位的依次為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，與CHINET的調查結果一致[10]。

NDM型碳青霉烯酶于2009年在印度新德里被發現后迅速播散至全球，亞洲是產NDM型碳青霉烯酶菌株流行的主要區域[11-13]。本研究通過對78株耐碳青霉烯類大腸埃希菌(CREC)的基因檢測發現，大腸埃希菌以NDM基因最多(65株)，耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌也以NDM耐藥基因為主，占比達85.7%(24/28)。NDM耐藥基因表型的傳播機制不同于其他碳青霉烯酶，該基因型多見于我國北方醫院[14]。新型含酶抑制劑的復方制劑頭孢他啶-阿維巴坦對產金屬酶的CRE無效，但卻是目前治療產KPC型和OXA-48型CRE的最好藥物[15]，并且該藥適用于復雜性尿路感染和院內獲得性肺炎[16]，是治療CRE感染的理想藥物。

自2007年浙江省報道CRKP后，相關研究也證實KPC基因是我國肺炎克雷伯菌攜帶的最常見的碳青霉烯酶耐藥基因[17]。本研究通過對71株肺炎克雷伯菌的基因檢測發現，肺炎克雷伯菌以KPC耐藥基因最多(49株)，與前文報道一致。

OXA-48耐藥基因最早發現于2001年的土耳其，很快引起醫院內暴發流行，有研究表明OXA-48基因比KPC、NDM基因更易于在腸桿菌科細菌中播散[18]，主要在兒童患者中分離[19]。產VIM酶的CRKP最早于2001-2003年在南歐被發現，本研究發現1株攜帶VIM基因的肺炎克雷伯菌。

本研究49株CRKP的MLST結果顯示ST11型為主要的流行克隆株，占53.1%，這與ST11型CRKP為我國流行克隆株的報道一致[20]。

CRE引起的院內感染導致了病死率升高與醫療成本的明顯增加，鑒于目前CRE的治療難度，采取有效措施防止耐藥菌的蔓延為當務之急。對于此類耐藥細菌所致感染或定植的防控應多管齊下，有效感染防控措施包括手衛生、加強監測、接觸預防、患者隔離(單間隔離或集中隔離)和環境清潔等。