番鴨源鴨疫里默氏菌大環(huán)內(nèi)脂類藥物的耐藥基因檢測與分析

林彬彬 謝碧林 翁漢東 王秀禎 程龍飛 傅光華 劉榮昌 林志敏＊

（1.莆田市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建莆田 351144；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013）

鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）是一種黃桿菌科里默氏菌屬革蘭氏陰性菌，是在世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)的禽類主要病原菌之一，其引起的高傳染性和高病死率給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。主要感染鴨、雞、鵝和火雞等，并導(dǎo)致典型的漿膜炎和敗血癥，以嚴(yán)重的纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征。藥物是防治鴨疫里默氏菌病的主要方法，但藥物的廣泛使用也導(dǎo)致了耐藥性菌株的出現(xiàn)。

紅霉素、阿奇霉素是大環(huán)內(nèi)酯類藥物，可逆地與細(xì)菌的50S核糖體亞單位結(jié)合，抑制肽酰基轉(zhuǎn)移酶，阻止轉(zhuǎn)肽作用和mRNA位移，阻斷肽鏈延伸，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[1]。目前，臨床上鴨疫里默氏菌對紅霉素的耐藥性已越來越明顯[2-4]，其藥物應(yīng)用效果不甚理想。細(xì)菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要機制有四種，一是核糖體RNA的甲基化修飾，主要由紅霉素核糖體甲基化酶（erm）基因編碼的甲基化酶介導(dǎo)，使核糖體靶位點改變，導(dǎo)致藥物與核糖體的親和力降低而產(chǎn)生耐藥[5]；二是核糖體RNA基因發(fā)生點突變[6]；三是大環(huán)內(nèi)酯類相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶和紅霉素滅活酶的產(chǎn)生，如紅霉素酯酶（ere）可以水解破壞酯內(nèi)環(huán)而產(chǎn)生耐藥[7]；四是通過外排泵將藥物排出體外[8]。目前，erm基因家族有20多種基因型。有研究表明，ermF、ereD基因能引起鴨疫里默氏菌對紅霉素的耐藥[9-10]。本研究主要就莆田市鴨疫里默氏菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性以及相關(guān)耐藥基因的攜帶情況進(jìn)行分析，了解其耐藥水平及耐藥基因流行情況，探究鴨疫里默氏菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥機制，為臨床上鴨疫里默氏菌病大環(huán)內(nèi)酯類藥物的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 49株番鴨源鴨疫里默氏菌菌株，由本所實驗室分離并保存，所有菌株均已經(jīng)生化鑒定和PCR鑒定。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）、紅霉素藥敏紙片（藥物含量15μg/片）、阿奇霉素藥敏紙片（藥物含量15μg/片），均購于杭州微生物試劑有限公司；新生胎牛血清，購于浙江天杭生物科技股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、GeneRed核酸染料、DL2000 DNA Marker，購于天根生化科技有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)參考文獻(xiàn)[1,9,11]合成大環(huán) 內(nèi) 酯 類 相 關(guān) 耐 藥 基 因ermA、ermB、ermC、ermF、ereD等5種，引物序列及其反應(yīng)參數(shù)見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 鴨疫里默氏菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因引物

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性試驗 根據(jù)CLSI（2018）的要求，采用K-B紙片擴散法測定菌株對大環(huán)內(nèi)酯類藥物（紅霉素、阿奇霉素）的敏感性。取待測菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，置37℃搖床中，160 r/min培養(yǎng)24 h后，用滅菌生理鹽水將菌液濃度稀釋到0.5個麥?zhǔn)媳葷岫取Ｈ≌{(diào)整后的100μL菌液于TSA平板上并用無菌涂布棒均勻涂布，待晾干數(shù)分鐘后，用無菌鑷子夾取不同的藥敏紙片間隔一定距離貼于TSA平板上，置5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.2 耐藥基因的PCR擴增及序列分析 根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌株DNA為模板，采用PCR方法對菌株中可能存在的ermA、ermB、ermC、ermF、ereD等5種耐藥基因進(jìn)行擴增。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 25μL；上下游引物（10 uM）各1μL；DNA 2μL；補充ddH2O至終體積50μL。PCR擴增程序：96℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，各自退火溫度退火50 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72℃再延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增情況。選取部分陽性產(chǎn)物送生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，并將所得序列在NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行Blast分析。

2 結(jié) 果

2.1 耐藥表型結(jié)果 對49株鴨疫里默氏菌菌株進(jìn)行紅霉素、阿奇霉素2種藥物的藥敏試驗，結(jié)果表明（見表2），分離株對紅霉素、阿奇霉素的耐藥率很高，分別為100%、89.80%。

表2 菌株對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的敏感性

2.2 耐藥基因檢測結(jié)果 對49株鴨疫里默氏菌菌株進(jìn)行ermA、ermB、ermC、ermF、ereD等5種耐藥基因的PCR擴增及部分測序，測序結(jié)果在NCBI上Blast分析，結(jié)果顯示，ermF基因擴增序列與GeneBank登錄的基因同源性達(dá)99%以上，ereD基因擴增序列與GeneBank登錄的基因同源性達(dá)98%以上，表明所擴增結(jié)果正確。

耐藥基因的檢測結(jié)果顯示，在49株鴨疫里默氏菌菌株中共檢測到2種耐藥基因，分別為ermF（見圖1）、ereD（見圖2），檢出率分別為85.71%（42/49）、91.84%（45/49），見表3。沒有檢測到ermA、ermB、ermC等3種耐藥基因。

圖1 鴨疫里默氏菌ermF耐藥基因PCR電泳圖

圖2 鴨疫里默氏菌ereD耐藥基因PCR電泳圖

表3 菌株大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因檢測結(jié)果

2.3 耐藥表型與耐藥基因型相關(guān)性分析 49株鴨疫里默氏菌菌株對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥表型與耐藥基因型的結(jié)果比較（見表4），49株對紅霉素耐藥的鴨疫里默氏菌菌株中，85.71%菌株檢測到ermF耐藥基因，91.84%菌株檢測到ereD耐藥基因；44株對阿奇霉素耐藥的鴨疫里默氏菌菌株中，88.64%菌株檢測到ermF耐藥基因，95.45%菌株檢測到ereD耐藥基因；均未檢測到ermA、ermB、ermC等3種耐藥基因。可見，鴨疫里默氏菌菌株對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥表型與耐藥基因型的符合率比較高，在85.71%～95.45%。此外，在2株對阿奇霉素敏感的鴨疫里默氏菌菌株中檢測到ereD耐藥基因。

表4 49株鴨疫里默氏菌菌株大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥表型與耐藥基因型結(jié)果比較

3 討論

隨著細(xì)菌耐藥性的問題日益嚴(yán)重，其耐藥性檢測方法也變得至關(guān)重要。目前，臨床上檢測鴨疫里默氏菌耐藥性的常用方法是藥敏試驗，主要有K-B紙片法、肉湯稀釋法[1]、瓊脂稀釋法[12]等。K-B紙片法是應(yīng)用最為廣泛的一種試驗方法，它操作簡單，無需特殊儀器，結(jié)果易于觀察。程龍飛等[2]用K-B紙片法對福建省及鄰近省份423株鴨疫里默氏菌分離株進(jìn)行27種抗菌藥物的敏感性試驗，結(jié)果表明鴨疫里默氏菌分離株對多種藥物耐藥性很高，45%菌株對紅霉素耐藥。任曉梅等[3]用K-B紙片法對廣東省、山東省、江蘇省46株鴨疫里默氏菌分離株進(jìn)行14種抗菌藥物的敏感性試驗，結(jié)果表明鴨疫里默氏菌分離株呈現(xiàn)廣譜耐藥性且有一定的區(qū)域性差異，89.1%菌株對紅霉素耐藥。朱元軍等[4]用K-B紙片法對我國南方地區(qū)120株鴨疫里默氏菌分離株進(jìn)行16種抗菌藥物的敏感性試驗，結(jié)果表明鴨疫里默氏菌分離株中出現(xiàn)多重耐藥菌株，十一重耐藥菌株最多，75.8%菌株對紅霉素耐藥。本研究用K-B紙片法對莆田市49株番鴨源鴨疫里默氏菌菌株進(jìn)行紅霉素和阿奇霉素的敏感性試驗，結(jié)果表明絕大部分菌株對紅霉素和阿奇霉素耐藥，耐藥率達(dá)89.80%以上。總體看，目前鴨疫里默氏菌菌株對紅霉素、阿奇霉素等大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性還是很高，臨床上應(yīng)注意藥物的選擇和使用量。

藥敏試驗雖然是臨床上篩選敏感藥物和測定細(xì)菌耐藥性的有效方法，但存在測定時間長、操作復(fù)雜等缺點。而PCR技術(shù)具有時效快、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的耐藥基因檢測[13-15]。楊芳芳[16]應(yīng)用PCR技術(shù)首次在鴨疫里默氏菌中檢測到介導(dǎo)氨基糖苷類藥物耐藥的3種耐藥基因和介導(dǎo)喹諾酮類藥物低水平耐藥的2種耐藥基因。張亞楠[12]應(yīng)用PCR技術(shù)在115株鴨疫里默氏菌菌株中檢測出25種耐藥基因。包濤濤等[17]應(yīng)用PCR技術(shù)在6株鴨疫里默氏菌菌株中檢測出10種耐藥基因。本研究應(yīng)用PCR技術(shù)在49株番鴨源鴨疫里默氏菌菌株中成功檢測到大環(huán)內(nèi)酯類藥物的2種耐藥基因ermF、ereD，檢出率均比較高，分別為85.71%、91.84%，沒有檢測到ermA、ermB、ermC等3種耐藥基因。

Luo等[9]從全國不同地區(qū)分離得到的31%鴨疫里默氏菌菌株中檢測出ermF基因，并研究表明23S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因ermF介導(dǎo)的核糖體RNA修飾是引起鴨疫里默氏菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因。邢琳琳[1]研究也發(fā)現(xiàn)，ermF和ereD基因與鴨疫里默氏菌菌株的紅霉素抗性相關(guān)。張亞楠[12]應(yīng)用PCR技術(shù)對115株鴨疫里默氏菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因檢測中，發(fā)現(xiàn)96.5%菌株攜帶ermF基因，確定ermF基因是引起鴨疫里默氏菌對紅霉素產(chǎn)生耐藥性的主要原因，還從中首次檢出ermB和ermC基因。本研究從49株對紅霉素和44株對阿奇霉素耐藥的鴨疫里默氏菌菌株中，85.71%以上菌株檢測出ermF、ereD兩種耐藥基因，在鴨疫里默氏菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因中占主導(dǎo)作用。據(jù)此推測，目前莆田市鴨疫里默氏菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的主要原因是由ermF和ereD耐藥基因介導(dǎo)的，與現(xiàn)有研究結(jié)果一致。此外，在2株對阿奇霉素敏感的鴨疫里默氏菌菌株中也檢測到ereD耐藥基因，推測其耐藥基因未表達(dá)。

4 結(jié) 論

本研究對49株鴨疫里默氏菌菌株進(jìn)行了紅霉素、阿奇霉素2種藥物的藥敏試驗，結(jié)果表明，分離株對紅霉素、阿奇霉素的耐藥率很高，分別為100%、89.80%。莆田市鴨疫里默氏菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的主要原因是由ermF和ereD耐藥基因介導(dǎo)的。