偽狂犬病病毒FJMH1907b株的分離和gD基因的演化分析

吳學敏 汪翊靈 陳如敬 陳秋勇 王隆柏 車勇良 嚴 山 劉玉濤 周倫江＊

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心 福州 350013；2.閩侯縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧獸醫(yī)站 福建閩侯 350100）

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一種神經(jīng)性皰疹病毒，可感染多種哺乳動物，包括反芻動物、食肉動物和嚙齒動物，導致易感動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1-2]。豬是PRV的天然宿主，偽狂犬病（Pseudorabies，PR）對養(yǎng)豬業(yè)危害性大，具有高度隱性感染的特點，可引起持續(xù)性感染，特別是耐過的母豬呈長期帶毒生產(chǎn)[3]。2011年以來，我國許多規(guī)模化豬場暴發(fā)了PR，主要表現(xiàn)為豬群PRV-gE抗體陽性率顯著升高，普遍出現(xiàn)母豬流產(chǎn)、仔豬神經(jīng)癥狀和病死率高等臨床情況，近幾年還相繼發(fā)現(xiàn)免疫PR疫苗的養(yǎng)豬場發(fā)生偽狂犬病，并分離到新的PRV流行毒株[4-6]，相關研究表明，新分離的PRV毒株出現(xiàn)了變異，而經(jīng)典毒株的疫苗未能完全保護新型強毒力PRV的感染[7-10]。PRV已發(fā)現(xiàn)16種囊膜蛋白，其中11種功能性囊膜蛋白，gD（US6）為糖基化蛋白，是PRV的主要免疫原之一，在病毒感染細胞至復制生長過程中起著重要的作用，也最先被機體免疫系統(tǒng)識別引起免疫應答[11-12]。研究表明，gD蛋白抗體是主要中和抗體之一，能夠充分中和PRV，且不存在補體時也能有效中和[13]。本研究對福建省閩侯縣發(fā)生疑似PR的豬場進行PRV分離鑒定，再對新分離PRV毒株gD基因進行PCR擴增，通過測序比對分析，探究豬偽狂犬病病毒gD基因的遺傳進化規(guī)律，為PR預防和控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞與病毒 PK-15細胞由本研究室保存，用于病毒分離和傳代培養(yǎng)；偽狂犬病病毒參考毒株Fa株由本研究室保存。

1.2 病料與病毒分離 從福建省閩侯縣某豬場采集疑似PRV感染豬的腦、肺、脾臟和肝臟組織，參考文獻[7]的方法，處理病料并接種于PK-15細胞，將發(fā)生病變的細胞傳至3～4代，待細胞70%發(fā)生病變時收獲病毒液，凍存于-80℃，備用。

1.3 主要試劑 病毒核酸提取試劑盒、PCR擴增高保真酶Mix、GC Buffer等均購自北京全式金公司；DMEM培養(yǎng)基和胰酶購自HyClone公司；犢牛血清購自杭州四季青公司；瓊脂糖、10×TAE緩沖液購自北京索萊寶公司。

1.4 引物設計合成 參考GenBank中PRV基因序列（NC_006151），設計擴增gE基因保守序列的引物和gD基因的引物，序列分別為gE-F：5'-AACTATGGCATGACCGCCAA-3'，gE-R：5'-GTGGAGAAGAAGAGTCCGGC-3'；引物gD-F：5'-ATGATGATGGTGGCGCGCGAC-3'，gD-R：5'-TTATTGTTCTTCTGCGATGGTGGCGAG-3'。引物由鉑尚生物技術公司合成，兩對引物預計擴增的片段大小分別為612 bp和1 100 bp。

1.5 PCR檢測鑒定 按照病毒核酸提取試劑盒說明書提取組織上清液和病毒培養(yǎng)液的病毒DNA作為模板，以Fa株的核酸作為陽性對照，用gE引物進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察鑒定。

1.6 gD基因擴增 以分離的病毒DNA為模板，用gD引物進行PCR擴增反應，反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃復性45 s，72℃延伸45 s，進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。反應結束，取5μL于1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，并將目的條帶膠回收，送上海鉑尚生物技術公司測序。

1.7 gD基因序列及氨基酸序列分析 將測序結果用DNAStar軟件中SeqBulider程序推導對應的氨基酸序列，挑選GenBank中登錄的具有代表性的15個毒株使用MEGA 5.05和MegAlign軟件進行同源性比對分析，并構建遺傳進化分析樹，探究它們的親緣關系。選取的毒株為Fa株（AY196984）、Min-A株（AY169694）、La株（AY174090）、SA215株（DQ367438）、FZ株（EF645837）、TJ株（KJ789182）、LC株（MF434034）、FJ-Y21株（MK922107）、HNXY株（MN003373）、Anhui-ZJ1株（MK922121）、Kaplan株（AJ271966）、Becker株（AY368490）、NiA3株（KU900059）、Yangsan株（AY217094）和疫苗毒Bartha株（KY398733）。

2 結果與分析

2.1 病毒分離鑒定 于PK-15細胞上穩(wěn)定傳代的病毒，待接種48 h后可見細胞變圓，出現(xiàn)合胞體，約70%細胞出現(xiàn)病變時收起，進行PCR檢測鑒定，以Fa株作為陽性對照，結果見圖1，分離到的病毒與陽性對照在600 bp處出現(xiàn)明顯條帶，并對PCR產(chǎn)物進行測序，與GenBank中PRV-gD基因序列一致，表明分離的病毒為PRV，命名為FJMH1907b。

圖1 PCR鑒定電泳圖

2.2 gD基因擴增結果 以分離的病毒FJMH1907b株和Fa株核酸為模板，PCR擴增gD基因，結果見圖2，均在1 100 bp處出現(xiàn)預期條帶，將條帶回收送檢測序。

圖2 gD基因PCR擴增電泳圖

2.3 gD核苷酸序列比對分析 將FJMH1907b株gD基因片段擴增測序結果，與GenBank中收錄的15株PRV對應核苷酸序列進行比對分析，由構建的遺傳進化樹可見，新分離FJMH1907b毒株與國外Kaplan毒株及疫苗毒Bartha株不屬于一個大的分支上，與國內FJ-Y21株、Anhui-ZJ1株、LC株及TJ株同屬一個小分支上（見圖3）。

圖3 PRV-gD基因核苷酸序列遺傳進化樹

2.4 gD基因推導氨基酸序列比較 將gD基因推導的氨基酸序列進行比較分析，結果顯示（見圖4）推導出對應氨基酸共369aa，差異較大的區(qū)域集中在aa278～aa282，存在連續(xù)氨基酸缺失或增加，另aa287、aa341存在A-V和P-Q互換；部分毒株個別氨基酸也存在突變，主要變化有A105V、I121V、R276K、F323L、S355P，其中疫苗毒Bartha株的aa81存在N突變成S，新分離FJMH1907b株的aa271存在R突變成Q。

圖4 gD基因推導氨基酸序列比較

2.5 gD基因推導氨基酸序列比對分析 將gD基因推導的氨基酸序列進行比對分析，構建的遺傳進化樹顯示（見圖5），與核苷酸序列的比對結果相似，新分離FJMH1907b毒株處于相對獨立分支，與國外Kaplan毒株及疫苗毒Bartha株不屬于一個大的分支上，與國外Becker毒株、NiA3株也不在一個分支上，與國內Fa株、FZ株、FJ-Y21株、Anhui-ZJ1株、LC株及TJ株同屬一個較小分支上。

圖5 PRV-gD氨基酸序列遺傳進化樹

2.6 gD氨基酸同源性比較分析 根據(jù)推測的氨基酸序列，采用MAGE軟件比對獲得PRV gD蛋白氨基酸同源性比對矩陣，結果顯示（見圖6）：新分離FJMH1907b毒株與其它參考毒株的同源性為87.7%～100%，與國外毒株的同源性為87.7%～99.7%，其中與疫苗毒Bartha株的同源性僅87.7%、韓國Yangsan株為99.7%；與國內Fa株、FJ-Y21株、TJ株、Anhui-ZJ1株及LC株同源性為100%。

圖6 gD氨基酸序列同源性矩陣

3 討 論

PRV為線性雙股DNA病毒，基因全長約150 kb，其中G+C含量高達73%，編碼的囊膜蛋白中有11種是糖偶聯(lián)蛋白，包括gL、gH、gB、gC、gN、gD、gI和gE蛋白等，大部分與病毒的入侵感染和復制生長增殖密切相關，部分也直接參與宿主的免疫反應，產(chǎn)生相應的抗體[1,2,14-15]。gD蛋白也是主要免疫原性糖蛋白之一，是病毒感染過程所必需的，具有高度保守性，是機體中和抗體的目標蛋白之一[11]。gD蛋白氨基酸序列分析和蛋白空間構象研究表明，gD蛋白具有跨膜區(qū)、細胞膜結合位點和信號肽區(qū)的典型免疫活性特性[16]。自2011年以來，我國出現(xiàn)新的PRV流行毒株，陸續(xù)相關研究發(fā)現(xiàn)新毒株毒力基因和抗原保護性基因均出現(xiàn)一定的變異，也給該病的防控帶來新的挑戰(zhàn)[17]。部分規(guī)模化豬場的豬群PRV-gE抗體陽性率顯著升高，出現(xiàn)母豬流產(chǎn)、仔豬神經(jīng)癥狀和死亡率升高等情況，甚至還發(fā)現(xiàn)部分免疫PR疫苗的豬場發(fā)生偽狂犬病，并分離到新的PRV流行毒株。相關研究表明，新分離的PRV毒株出現(xiàn)了變異，而經(jīng)典毒株的疫苗未能完全保護新型強毒力PRV的感染[8-10]。

本研究對新分離的PRV毒株FJMH1907b株的gD基因核苷酸序列和對應氨基酸序列與參考毒株進行對比分析，結果顯示福建新分離FJMH1907b毒株與疫苗毒Bartha株不屬于一個大的分支上，且兩者對應的氨基酸序列同源性為87.7%，這可能是導致該豬場偽狂犬病免疫失敗而發(fā)病的原因之一，或PRV經(jīng)典毒株疫苗對新型毒株不能提供完全保護。PRV gD蛋白具有高度保守性，氨基酸序列比對分析結果顯示，不同地域分離的毒株具有一定差異，主要集中在aa278～aa282位置存在連續(xù)氨基酸缺失或增加，以及在aa276、aa287、aa341存在R-K、A-V和P-Q互換，新分離FJMH1907b株gD蛋白氨基酸也存在上述變化，同時在aa271存在R突變成Q。因此，本研究對PRV gD基因核苷酸序列和對應氨基酸序列進行對比分析發(fā)現(xiàn)，gD蛋白較保守，但存在一定地域差異性，與徐志文等研究結果一致[16]；與國外Bartha株存在較大的差異，兔源gD蛋白多抗血清對不同PRV毒株交叉中和效價差異不顯著[18]，或許PRV gD蛋白個別氨基酸的突變不會引起其抗原性重大改變，但新分離FJMH1907b株gD基因及對應氨基酸序列的比對分析結果，結合目前豬場PRV的流行情況，對該病的防控應因地制宜，定期做好病原學和血清學監(jiān)測，合理安排疫苗免疫。