梧州六堡茶中真菌多樣性分析及真菌毒素殘留量的測定

梁劍鋒，李亞*，賓月景，奚廣生，陳金輝，曾勇謀，陳美華

（1.梧州學院食品與制藥工程學院（六堡茶現代產業學院），廣西 梧州 543002；2.廣西六堡茶產業科研人才小高地，廣西 梧州 543002）

梧州六堡茶為中國名茶，具有1500多年歷史，采用特殊的渥堆、陳化等發酵工藝加工而成，梧州六堡茶以“紅、濃、陳、醇”特殊品質深受廣大消費者喜愛[1-3]。近年來消費者十分關注后發酵黑茶受到真菌毒素污染而引起的食品安全問題[4-5]。由于六堡茶屬于后發酵的黑茶，因此其飲用安全性也受到廣大消費者的關注[6-8]。雖然六堡茶在加工過程中有高溫雙蒸、干燥等工藝進行滅菌，但是在渥堆發酵、陳化、倉儲過程中六堡茶水分比較高，容易滋生真菌，存在受到真菌毒素污染的風險。目前國內對六堡茶中真菌分布情況以及是否會產生有害真菌毒素等問題鮮有研究。因此，對六堡茶中真菌毒素種類及關鍵的真菌毒素含量進行相關研究，對確保廣大六堡茶消費者飲用安全具有一定研究與現實意義[9-11]。

六堡茶中在發酵陳化過程中各類真菌種類、數量繁多，而且不同企業、原料生產六堡茶其微生物多樣性也變化較大；如果僅從形態學、生理學、微生物學的特征上分析，難以準確分離和鑒定[9-11]。隨著基因測序技術的出現，高通量測序技術快速發展，該技術采用合成與測序同時進行方法對樣本的DNA分子進行測序，具有檢測速度快、檢驗量大、結果精密度高的優點。該技術廣泛應用可以為分析六堡茶中真菌菌群結構提供技術手段。

茶葉中常見真菌有黑曲霉、米曲霉、寄生曲霉、黃曲霉、土曲霉、雜色曲霉、煙曲霉和構巢曲霉等[14-16]。黃曲霉常見有害代謝物包括黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素 G1、黃曲霉毒素 G2、黃曲霉毒素 M1、黃曲霉毒素M2[17]和赭曲霉毒素A[18-19]；鐮刀菌產生的有害代謝物包括伏馬菌素[20]、雪腐鐮刀菌烯醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮[21]、鐮刀菌烯酮X和T-2毒素等單端孢霉烯族毒素[22-23]。茶葉中青霉屬常見的有黃綠青霉（P.citreo-viride）、桔青霉（P.citrinum）、產黃青霉（P.chrysogenum）、婁地青霉（P.roqueforti）、展青霉（P.patulum）、繩狀青霉（P.funiculosum）和產紫青霉（P.purpurogenum）等，日常生活中青霉素有害代謝產物為桔青霉素[24-25]。

本文采用基于18S宏基因組測序技術的Illumina HiSeq TM2500分析儀器，提取六堡茶DNA樣本后，利用ITS1F和ITS2R序列測定方法，分析對比10種不同廠家、批次、年份的六堡茶中的真菌微生物組成。同時采用 QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、rugged、safe）-液相/質譜聯用方法，分析樣品中常見真菌的代謝毒素殘留量。通過研究樣品探討六堡茶中真菌毒素群落結構、組成，并對食品中常見的真菌素殘進行留量檢測分析，為科學防控六堡茶中真菌毒素對消費者可能產生的食品安全風險，提供實際檢測數據與理論研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與設備

樣品：市售不同廠家、批次、年份（陳化時間1年～12年）的六堡茶成品10份。樣品具體編號、陳化開始時間及樣品含水量見表1。

表1 試驗樣品信息Table 1 Test sample information

16種真菌毒素標準物質（純度＞98%）：美國Romer Labs公司；DNA提取試劑：北京諾博萊德科技公司；乙腈（色譜純）：美國霍尼韋爾公司；甲酸（色譜純）：美國熱電公司；HC-C18型吸附劑（40 μm～60 μm）、N-丙基乙二胺（40 μm～60 μm）：上海安譜實驗科技股份有限公司；硫酸鎂（分析純）：西隴化工股份有限公司。凈化管：分別稱取80 mg N-丙基乙二胺、0.25 g硫酸鎂、15 mg HC-C18至2.0 mL離心管中。

LC1290-QQQ6490液質聯用儀：美國安捷倫公司；X-30R冷凍離心機：德國貝克曼庫爾特公司。

1.2 樣品總DNA提取方法

按照提取試劑的使用說明對六堡茶樣品進行真菌的DNA進行提取。

1.3 聚合酶鏈式反應擴增

提取樣品中真菌毒素DNA，對DNA的濃度和質量進行檢測后，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物質量并進行擴增，樣品真菌ITS檢測選用引物為ITS1F-ITS2R （ITS1F：5′－CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA－3′，ITS2R：5′－GCTGCGTTCTTCATCGATGC－3′）。

1.4 測序

樣品中真菌毒素ITS測序試驗由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.5 真菌多樣性數據處理和分析

對高通量測序檢測到的數據與已有的ITS區數據庫進行對比分析。對檢測到的數據進行過濾拼接，獲得有效序列。利用R語言中的函數制作微生物群落組成的柱狀分析圖。相關數據統計利用Excel軟件。

1.6 樣品中真菌毒素殘留量測定方法

1.6.1 QuEChERS樣品前處理方法

采用中藥粉碎機對六堡茶樣品進行粉碎并過80目篩后混勻，先在離心管（50 mL）中稱取2.50 g樣品，向離心管中小心逐滴加入2.0 mL純水濕潤樣品，加入20.0 mL有機提取溶劑（1%甲酸-乙腈溶液）后用渦旋混合器振搖3 min，4℃下4 000 r/min離心10 min，取出后放置恢復至室溫（25℃）分層；吸取1.0 mL上層澄清液到凈化管中，在渦旋混合器混勻3 min后冷凍離心分離（15 000 r/min、4℃、10 min），取出待離心管恢復至室溫（25℃）、分層后取上層澄清液過濾膜（孔徑0.22 μm）后上機檢測。

1.6.2 色譜條件

表2 流動相梯度洗脫程序Table 2 Mobile phase gradient elution procedure

1.6.3 質譜條件

電噴霧離子源（electron spray ionization，EI）；采用正負離子源切換模式掃描；毛細管電壓4 000 V；干燥氣溫度325℃；干燥氣流速9 L/min；其它參數見表3。

表3 質譜儀檢測參數Table 3 Detection parameters of mass spectrometer

2 結果與分析

2.1 門和屬分類水平下真菌類群分析

本文將六堡茶中真菌分為優勢門或屬（真菌的序列平均相對含量大于1.00%）、其它（真菌的序列平均相對含量小于1.00%）、不可鑒定（不能鑒定到門或者屬水平真菌的序列）。

2.1.1 基于門分類學的真菌類群分析

門分類水平下，10批次六堡茶真菌類群結構分析見圖1。

圖1 基于門水平10個樣品中真菌類群的比較分析Fig.1 Comparative analysis of fungal groups in 10 samples based on phylum level

由圖1可知，10個六堡茶樣品中真菌類群主要是子囊菌門（Ascomycota），其相對含量在85.2%～94.2%，平均相對含量為90.9%；有3個樣品含有擔子菌門（Basidiomycota），其相對含量在1.2%～3.2%。其中子囊菌門在同一產品系列中，平均含量隨著陳化時間先降后升。采用SPSS 25.0軟件經Mann-Whitney檢驗，采集的10個六堡茶樣品在門水平上真菌類群差異均不顯著（P＞0.05）。

2.1.2 基于屬分類學的真菌類群分析

屬分類水平下，10批次六堡茶樣品所有序列可鑒定出24個真菌屬，其中平均相對含量大于1.00%的有6個，具體真菌類群結構相對含量分析見圖2。

圖2 基于屬水平10個樣品中真菌類群的比較分析Fig.2 Comparative analysis of fungal groups in 10 samples based on genus level

由圖2可知，6個平均相對含量大于1.00%的真菌屬分別為曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、節擔菌屬（Wallemia）、肉座菌（Hypocreale）、芽生葡萄孢酵母屬（Blastobotrys）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces），其中10個樣品均含有曲霉屬，平均相對含量在50.6%～99.9%，10個樣品曲霉屬平均相對含量為86.4%，是六堡茶樣品的優勢真菌屬。采用SPSS 25.0軟件經Mann-Whitney檢驗發現，編號LBC-6、LBC-8、LBC-10 3個樣品中曲霉屬（Aspergillus）含量差異明顯，其平均相對含量分別為50.6%、89.2%、57.9%。

2.2 樣品中16種真菌毒素殘留量檢測結果

試驗檢測真菌毒素線性范圍、檢出限、定量限和10批次六堡茶樣品中16種真菌毒素殘留量見表4。

表4 真菌毒素線性范圍、檢出限、定量限Table 4 Linear range，limit of detection and limit of quantification of mycotoxins

由表4可知，本文試驗方法的檢出限、定量限與現行國家標準相一致；通過對10批次六堡茶樣品中常見16種真菌毒素殘留量檢測，檢測結果為均未檢出。初步研究表明，樣品六堡茶中真菌雖以曲霉類為主，但暫未發現以上常見的有害真菌代謝毒素殘留。

3 結論

本試驗首先對不同年份、不同企業生產的10批次六堡茶樣品進行茶葉樣品的總DNA提取，采用18S宏基因組測序技術進行ITS測序與分析，結果表明：10個六堡茶樣品在門分類水平真菌類群主要是子囊菌門，其平均相對含量在85.2%～94.2%，平均相對含量90.9%；在屬分類水平6個平均相對含量大于1.00%的依次為曲霉屬、青霉屬、節擔菌屬、肉座菌、芽生葡萄孢酵母屬、德巴利氏酵母屬，其中10個樣品均含有曲霉屬，平均相對含量在50.6%～99.9%，10個樣品曲霉屬平均相對含量為86.4%。采用超高效液相-質譜聯用儀對實際樣品中黃曲霉毒素、伏馬毒素等真菌代謝毒素殘留量進行檢測分析，結果表明樣品中16種真菌毒素殘留量小于方法檢出限，檢測結果為未檢出。試驗表明，六堡茶樣品中真菌以曲霉屬、青霉屬為主，暫未發現以上16種有害真菌代謝毒素殘留。