枸杞蜜中多酚類成分鑒定及指紋圖譜建立

林珣，杜一男，，張根生，山永凱，張紅城，，董捷*

（1.中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093；2.哈爾濱商業大學，黑龍江 哈爾濱 150010；3.青海花賜生物科技有限公司，青海 西寧 810000）

蜂蜜是一種成分復雜的天然甜味劑，主要由碳水化合物和水組成，并含有少量其他成分，如有機酸、礦物質、維生素、酶、蛋白質、氨基酸、揮發性化合物和植物化合物等[1]。蜂蜜不易變質[2]，在室溫18℃干燥條件下保存即可。蜂蜜除食用外，還能夠治療口腔潰瘍[3]、促進傷口愈合[4]、調節腸胃。蜂蜜的抗氧化活性使其在氧化應激相關慢性疾病中發揮重要作用[5-7]。蜂蜜具有廣譜抑菌性[8-9]，蜂蜜的高滲透壓、低pH值、低水分活度等特性[10-11]，以及存在一些多酚類物質使其具有很好的抗菌效果[12]。蜂蜜中的多酚類成分還具有抗炎作用，能夠降低炎癥反應[13-14]。蜂蜜所具有的抗氧化、抗菌、抗炎等多種功能活性[15-17]是蜂蜜獨特的營養優勢。

枸杞蜜是我國西北地區的特色蜂蜜，呈琥珀色或深琥珀色。枸杞蜜的產地集中在青海、寧夏等地。枸杞蜜的蜜源植物為枸杞[18-19]。枸杞作為我國珍貴的中藥材，有很高的藥用價值，但對于枸杞蜜中多酚類成分研究較少，分析枸杞蜜中多酚類化合物成分對提高其附加值具有重要意義[20]。本研究采用高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法，對枸杞蜜中多酚類化合物進行結構鑒定和定量分析，同時建立了枸杞蜜的標準指紋圖譜，對市售商品蜜進行真實性評價，以期為提高枸杞蜜附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞蜜樣品：中國農業科學院蜜蜂研究所提供，來自于青海、寧夏、陜西，并按收集時間對樣品進行編號（S1～S8）；枸杞蜜：市售。

甲酸、甲醇、氨水（均為分析純）：北京奧維森科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙酸（色譜純）、乙酸（質譜級）：美國賽默飛世爾公司；P-香豆酸、短葉松素、柯因、松屬素：美國Sigma公司；紅花菜豆酸、三-對-香豆酰亞精胺：中國農業科學院蜜蜂所蜂產品加工與功能評價實驗室自制；試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

BSA124S-CW型分析天平：美國Sartorrius公司；SevenEasyS20型pH計：瑞士Mettler公司；Thermo Sorvall Biofuge Startos臺式離心機：美國Thermo Fisher公司；Strata-X-A固相萃取柱、Phenomenex Gemini C18色譜柱：美國Phenomenex公司；Finnpipette F1單道移液器：美國Thermo Scientific公司；0.22 μm微孔濾膜：德國Merk Milipore公司；SB-80DTD全自動超聲波清洗裝置：昆山超聲儀器有限公司；LC-6AD型高效液相色譜儀：日本Shimedzu公司；6500型Q-TOF液相質譜聯用儀：美國Agilent公司；DN-24W氮吹儀：上海達洛科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蜂蜜中多酚類成分的富集

參考喬江濤[21]的研究方法，用Strata-X-A型固相萃取柱對枸杞蜜中的多酚類成分進行富集。

1.3.2 蜂蜜高效液相色譜分析條件

Phenomenex Gemini C18色譜柱、柱溫箱溫度35℃、枸杞蜜的檢測波長280 nm、樣品進樣量20 μL，總流速0.7 mL/min。流動相A為0.2%乙酸水溶液，流動相B為0.2%乙酸甲醇溶液。枸杞蜜梯度洗脫程序如下：0～10 min，5%～9%B；11 min～17 min，9%～15%B；18 min～30min，15%～18%B；31min～33 min，18%～23%B；34 min～39min，23%～27%B；40min～46 min，27%～31%B；47 min～55min，31%～34%B；56min～60min，34%～35%B；61min～70min，35%～36%B；71min～80min，36%～40%B；81min～90 min，40%～44%B；91 min～100 min，44%～51%B；101 min～105 min，51%～55%B；106 min～110 min，56%～58%B；111 min～120 min，58%～63%B；121 min～130 min，63%～70%B；131 min～135 min，70%～80%B；136 min～145 min，5%～9%B。

1.3.3 質譜分析條件

質譜分析條件：離子源為電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）、離子源噴射電壓 4 kV、出口電壓130 V、加熱溫度 350 ℃、氮氣（N2）流速 11 L／min、碰撞氣體為氦氣、霧化氣流速80 kPa、霧化器壓力40 psi（1 psi=6 895 Pa）、質量掃描范圍為m/z100～900。

1.3.4 蜂蜜中多酚類成分定量分析

稱取紅花菜豆酸、三-對-香豆酰亞精胺、反，反式脫落酸、花旗松素、順，反式脫落酸，配制梯度濃度標準品溶液。根據梯度濃度及相應峰面積建立標準曲線，采取5點式確保所測物質含量的上限和下限。其中x為標準品的濃度，y為峰面積。

1.3.5 蜂蜜中多酚類化合物成分指紋圖譜的建立

原料蜜的高效液相色譜圖通過質譜軟件生成所需格式，將此數據利用中藥色譜指紋圖譜[22]相似度評價系統進行分析，在此過程中對比并記錄各個樣品中的色譜峰相似度，并在允許范圍內進行多點校正。

1.4 數據分析

定量試驗重復3次，使用SPSS 16.0軟件進行分析。采用高效液相色譜法、中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統進行色譜相似度和指紋圖譜分析。

2 結果分析

2.1 枸杞蜜中多酚類成分鑒定

枸杞蜜的高效液相色譜圖如圖1所示。化合物1的一級質譜圖及二級質譜圖如圖2、圖3所示。

圖1 枸杞蜜樣品的HPLC圖Fig.1 Chromatograms of wolfberry honey

圖2 化合物1正負離子模式下的一級質譜圖Fig.2 Primary mass spectrum of compounds 1 in positive and negative ion modes

圖3 化合物1在負離子模式下的二級質譜圖Fig.3 Secondary mass spectrum of compounds 1 in negative ion mode

如圖2所示，正離子模式下有m/z303.1176[M+Na]+的準分子離子峰，負離子模式下有m/z 279.1221[M-H]-的準分子離子峰，判斷其分子量為280 Da，且為偶電子離子，從而得到化合物分子式為C15H20O5，計算不飽和度（環加雙鍵值）為6。根據該化合物的二級質譜碎片特征（圖3）及斷裂規律，加入標準品驗證，判斷該化合物為紅花菜豆酸，并推導其裂解途徑，結果如圖4所示。

圖4 化合物1在負離子模式下質譜裂解途徑Fig.4 Mass spectrum cleavage pathway of compound 1 in negative ion mode

化合物2的一級質譜圖及二級質譜圖如圖5、圖6所示。

圖5 化合物2在正負離子模式下一級質譜圖Fig.5 Primary mass spectrum of composition 2 in positive and negative ion modes

圖6 化合物2在正離子模式下的二級質譜圖Fig.6 Secondary mass spectrum of composition 2 in positive ion modes

如圖5所示，正離子模式下有m/z 305.060 9[M+H]+的準分子離子峰，負離子模式下有m/z 303.049 3[M-H]-的準分子離子峰。判斷其分子量為304 Da，通過相關文獻、二級質譜斷裂信息（圖6）以及標準品驗證，確定該化合物為花旗松素。首次在枸杞蜜中發現花旗松素，所以將花旗松素作為枸杞蜜的特征性成分。

化合物3的一級質譜圖及其二級質譜圖如圖7、圖8所示。

圖7 化合物3在正負離子模式下一級質譜圖Fig.7 Primary mass spectrum of composition 3 in positive and negative ion modes

圖8 化合物3在正離子模式下的二級質譜圖Fig.8 Secondary mass spectrum of composition 3 in positive ion modes

如圖7所示，正離子模式下有m/z627.1453[M+H]+、m/z 649.131 6[M+Na]+的準分子離子峰，負離子模式下有m/z 625.142 1[M-H]-的準分子離子峰。判斷其分子量為626 Da。由圖8可知，m/z 627.145 3[M+H]+準分子離子峰連續斷裂2個m/z162碎片，產生碎片離子m/z 465[M+H-162]+和m/z 303[M+H-162-162]+。碎片離子m/z 303[C15H10O7+H]+來自苷元槲皮素（C15H10O7）。故該化合物為槲皮素-二-葡萄糖苷，后經標準品驗證為槲皮素-3-O-槐糖苷。

化合物4、5根據高效液相色譜峰的出峰時間和最大紫外吸收以及標準品驗證，判斷其分別為反，反式脫落酸和順，反式脫落酸。化合物6、7、8、9的一級質譜圖及其二級質譜圖如圖9、圖10所示。

圖9 化合物6、7、8、9在正負離子模式下一級質譜圖Fig.9 Primary mass spectrum of composition 6，7，8，9 in positive and negative ion modes

圖10 化合物6、7、8、9在正離子模式下的二級質譜圖Fig.10 Secondary mass spectrum of composition 6，7，8，9 in positive ion modes

如圖9所示，化合物6、7、8、9均為亞精胺類化合物，在正離子模式下有m/z 584[M+H]+、m/z 606[M+Na]+的準分子離子峰，在負離子模式下有m/z 582[M-H]-的準分子離子峰，因此確定這4個化合物分子量均為583 Da；在二級質譜圖中發現，4個化合物的斷裂規律相同：由準分子離子峰m/z 584[M+H]+連續斷裂3個香豆酰碎片后，產生分子離子碎片峰m/z 438[M+H]+、m/z 292[M+H]+，最終得到相對分子質量145 Da，即為亞精胺。根據紫外吸收不同區分4個同分異構體。化合物6、7、8、9結構如圖11所示。

圖11 三-對-香豆酰亞精胺結構圖Fig.11 Structural diagram of P-coumaroyl spermidine

枸杞蜜樣品成分信息見表1。

表1 枸杞蜜樣品成分信息Table 1 Composition information in wolfberry honey samples

2.2 枸杞蜜中多酚類成分定量分析

標準品標準曲線的相關系數以及回歸方程如表2所示，計算得到枸杞蜜中多酚類化合物含量見表3。

表3 枸杞蜜中多酚類化合物含量Table 3 Contents of phytochemicals in wolfberry honey samples mg/kg

如表3所示，在所有樣品中均檢測出了枸杞蜜中的9個多酚類成分。其中，順，反式脫落酸含量最高，含量范圍在2.39 mg/kg～6.02 mg/kg。除順，反式脫落酸外，枸杞蜜中含量較高的為紅花菜豆酸，平均含量為3.00 mg/kg。此外，花旗松素、槲皮素-3-O-槐糖苷的平均含量分別為1.51 mg/kg和0.41 mg/kg。4個三對香豆酰亞精胺的含量總和在0.48 mg/kg～6.72 mg/kg，平均含量為0.41 mg/kg。

2.3 枸杞蜜多酚類成分指紋圖譜建立

將枸杞蜜原料蜜樣品的色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統中進行分析，對色譜峰進行匹配和多點校正，并最終生成枸杞原料蜜指紋圖譜見圖12，選擇具有代表性的9個峰，模擬生成具有代表意義的枸杞蜜的標準指紋圖譜見圖13。

圖12 所有枸杞原料蜜樣品生成的指紋圖譜Fig.12 Fingerprints of wolfberry raw honey samples

圖13 枸杞蜜的標準指紋圖譜Fig.13 Fingerprints of wolfberry honey

枸杞蜜原料蜜樣品之間的相似度見表4。

表4 枸杞原料蜜樣品之間的相似度Table 4 Similarity analysis between safflower raw honey samples

由表4可知，將8個樣品的高效液相色譜圖與標準指紋圖譜進行比較，結果顯示相似度范圍在0.85～0.99之間，說明所有枸杞原料蜜樣品之間相似度較高。

2.4 市售商品枸杞蜜的真實性評價

市售枸杞蜜高效液相色譜圖如圖14所示。

圖14 不同品牌的枸杞蜜高效液相色譜圖Fig.14 Different brands of wolfberry honey by high performance liquid chromatography

由圖14可知，品牌A、B、C色譜圖與標準指紋圖譜較一致，枸杞蜜中的特征性化合物花旗松素均存在。表明這3個品牌的枸杞蜜與真正的枸杞蜜一致。品牌D中雖然存在枸杞蜜的特征性成分花旗松素，但是其色譜圖與標準指紋圖譜比較存在較大的差異，存在較明顯的雜峰，推測該品牌的枸杞蜜不純，可能存在其他品種的蜂蜜，造成了色譜圖中雜峰的存在。

3 結論

通過高效液相色譜-串聯質譜技術對枸杞蜜中的多酚類成分進行鑒定，共鑒定出枸杞蜜中9種多酚類成分，分別為花旗松素、紅花菜豆酸、槲皮素-3-O-槐糖苷、反，反式脫落酸、順，反式脫落酸以及4個三對香豆酰亞精胺，并將花旗松素定為枸杞蜜的特征性成分。

對8個原料枸杞蜜樣品中多酚類成分定量分析，發現順，反式脫落酸含量最高，含量范圍為2.39 mg/kg～6.02 mg/kg。除了順，反式脫落酸，枸杞蜜中紅花菜豆酸含量也較高，平均含量為3.00 mg/kg。花旗松素的平均含量為1.51 mg/kg、槲皮素-3-O-槐糖苷的平均含量為0.41 mg/kg。4個三對香豆酰亞精胺的含量總和在0.48 mg/kg～6.72 mg/kg之間，平均含量為0.41 mg/kg。

在中藥指紋圖譜相似度評價系統中生成具有代表意義的枸杞蜜標準指紋圖譜，并通過相似度計算，結果表明所有枸杞原料蜜樣品整體較一致。分析市面上銷售的4個枸杞蜜樣品，發現整體情況較好，其中3個品牌枸杞蜜品質較好，有一個品牌枸杞蜜為摻假蜂蜜。