乳糖/水二元溶液的熱歷史和塌陷現象分析

田津津，王鴻宇，孫娜，張哲，劉衛賓，陳佳楠，計宏偉

（天津商業大學機械工程學院，天津 300134）

目前，真空冷凍干燥技術廣泛應用于食品、藥品及生物制品的保存。食品包括肉類、魚類及果蔬等，相比于傳統干燥技術，通過真空冷凍干燥技術凍干后的果蔬在外觀、顏色、抗氧化活性、植物化學成分及風味等方面都有明顯的優勢[1-4]。肉類和魚類方面的應用[5-6]優勢在其貨架壽命和食用價值[7]。在藥品方面的應用優勢主要是針對一些熱敏性以及一些難溶或不溶于水的藥物，使其能夠更好地保留原有的微觀結構，提高藥物穩定性，延長保存時間等[8]。但該技術面臨諸多的技術難題，如能耗大、效率低和樣品損傷等問題。

在真空冷凍干燥過程中，塌陷溫度Tc與玻璃化轉變溫度Tg′有著密切的關系，Tg′是凍干過程中最大的凍結濃縮液溫度。對于一些高要求的藥品，以Tg′作為凍干過程升華的臨界溫度時可防止凍結濃縮液塌陷破壞原有結構。研究表明不同樣品測定的Tc與Tg′存在一定的差值。溫度高于Tg′時凍結基質黏度降低，而塌陷溫度Tc通常比Tg′高出1 ℃～3 ℃[9]，因固體剛性不足以支撐多孔海綿干燥層質量而發生結構塌陷[10]。干燥升華過程中Tg′是重要的參考依據，溫度高于濃縮液的Tg′時黏度降低，當黏度低于10 Pa·s 時，材料出現實質性變化[11-12]，由于表面張力的存在使升華通道進行合并，干燥層機械強度降低，出現塌陷現象[13-14]，且不同濃度的蔗糖作為保護蛋白質的制劑凍干后會發生不同程度的塌陷[15]。左建國等[16]在對叔丁醇/蔗糖水三元溶液的研究中發現，Tc比對應溶液的Tg′高出1.5 ℃。楊智等[17]研究果糖、蔗糖、海藻糖和氯化鈉水的二元溶液發現，Tc比對應溶液的Tg′高5 ℃左右。

Tg′在生物低溫保存領域日益被重視[18]，真空冷凍干燥技術通過采用高的降溫速率和添加保護劑使溶液降溫至Tg′以下，細胞達到休眠狀態，為細胞營造了玻璃態環境，減少了晶體的生成，避免晶體對細胞造成機械損傷，提升了細胞存活率，延長了物品保存時間[19-20]。樣品種類的不同或同一樣品的不同降溫、升溫速率均會對Tg′產生一定的影響，其中降溫速率對Tg′的影響較小[21]。Yazdi 等[22]測定發現升溫速率對Tg′能夠產生一定的影響，由于熱阻存在，升溫速率越大熱滯后越大，Tg′隨之上升。Knopp 等[23]研究蔗糖溶液的熱分析和凍干顯微圖中低溫轉變和高溫轉變的關系，通過與塌陷溫度作對比，確定低溫轉變為玻璃化轉變溫度Tg′，高溫轉變為延遲溶解溫度。

國內對于保護劑特性和凍干過程影響因素的研究較少，多數是通過Tg′來粗略地判定塌陷溫度Tc。由于對玻璃化轉變的研究不夠深入，常會混淆溶液的延遲溶解和玻璃化轉變過程。本文以凍干保護劑乳糖為研究對象，分析不同降溫速率下Tg′與Tc的相關性，為了解凍干保護劑特性和升華臨界溫度提供參考。

1 材料與儀器

1.1 試劑與材料

乳糖：國藥集團化學試劑有限公司；液氮（純度＞99.99%）、氮氣（純度＞99.9%）：天津市永熙氣體有限公司；定性濾紙（孔徑15 μm～20 μm）：鄭州中天實驗儀器有限公司。試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

差示掃描量熱儀（DSC Q-1000）、坩堝壓片機（TP-1）：美國TA 公司；電子天平（FA2204C）：上海越平科學儀器制造有限公司；冷干臺（Linkam FDSC196）：英國林克曼科學儀器公司；光學顯微鏡（OLYMPUS BX-43）：日本奧林巴斯公司；真空泵（PFEIFFER D-35614）：德國普發技術有限公司；單道可調移液器（TopPeTTer）：北京大龍興創實驗儀器有限公司；磁力攪拌器（LCDMS-ProN1）：上海科興儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液制備

試驗所用溶液均按照質量濃度配制，以10%乳糖/水二元溶液為例。稱取乳糖10.000 0 g，加入超純水定容至100 mL。

1.3.2 試驗步驟

玻璃化轉化溫度測定：取12 μL 樣品溶液注入標準液體坩堝中，利用壓片機對坩堝密封處理。采用TA Universal Analysis 軟件分析熱流-溫度曲線中的過冷點、冰點、潛熱、玻璃化轉變溫度Tg′和冰的延遲溶解區間。

凍干過程觀察：在銀臺上涂一層導熱硅油，增強導熱效果。取2 μL 樣品溶液注射到載玻片上，用鑷子將載玻片放置在銀臺對應位置，然后封閉其腔體。將樣品從室溫（23 ℃～28 ℃）以特定速率降溫至Tg′以下，保持5 min，然后將冷熱臺腔體抽真空至設定壓力（在升溫中保持），將凍結的樣品以一定的升溫速率升溫至20 ℃后，進入脫水干燥階段。整個過程采用錄屏軟件和電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）相機拍攝相結合，確定圖片對應的溫度變化，記錄樣品從凍結到干燥的整個過程。使用自帶的軟件對圖片進行處理。

2 結果與分析

2.1 降溫速率對乳糖/水溶液凍結特性的影響

降溫速率對冰晶的形態、數量均有一定的影響。對于同一個樣品，當降溫速率增大時，晶體的成核率隨之增大[21]，但冰晶生長速率下降。

本研究以10%乳糖水二元溶液作為研究對象，冷凍過程的降溫速率分別設置為5、10、20、30、40 ℃/min將樣本從40 ℃降溫至-60 ℃，維持5 min 保證樣品充分凍結，然后以1 ℃/min 的升溫速率升至20 ℃，得到樣品的差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）曲線。通過放大升溫過程中的熱流-溫度曲線，分析轉變過程，并找到玻璃化轉變階段，確定玻璃化轉變溫度。

10%乳糖溶液在不同降溫速率下的熱流-溫度曲線如圖1 所示。通過放大和分析熱流曲線可得到表1。

圖1 10%乳糖溶液不同降溫速率下的熱流-溫度曲線Fig.1 Heat flow-temperature curves at different cooling rates of 10% lactose solution

表1 降溫速率對過冷度的影響Table 1 The effect of cooling rate on the degree of subcooling

由表1 可以看出，降溫速率在30 ℃/min 時過冷度最低。當降溫速率小于30 ℃/min 時，過冷度隨著降溫速率的增大而減小，則表明晶核的成核率降低。降溫速率大于30 ℃/min 時，過冷度隨著降溫速率的增大而增大，晶核成核率增大但是晶體小而密集。

在凍結樣品升溫過程中分析得到低溫和高溫轉變的溫度區間，低溫轉變溫度區間為-55 ℃～-38 ℃、高溫轉變溫度區間為-35 ℃～-20 ℃，低溫轉變溫度區間為玻璃化轉變過程。

圖2 為10%乳糖溶液在不同凍結速率情況下的DSC 匯總曲線。

圖2 10%乳糖溶液不同凍結速率的DSC 匯總曲線Fig.2 DSC summary curve of different freezing rates of 10% lactose solution

由圖2 可知，5 ℃/min～40 ℃/min 凍結時的熱流曲線變化趨勢相同，兩轉變區間基本保持不變，表明降溫速率對玻璃化轉變和凍結物的延遲溶解過程影響較小，間接證明了玻璃態的形成主要受到樣品本身的特性影響[21]；由于未發現明顯的反玻璃化現象，表明降溫速率對反玻璃化影響較小。圖3 為凍結速率對10%乳糖溶液轉變的影響。

圖3 凍結速率對10%乳糖溶液轉變的影響Fig.3 The effect of freezing rates on the transformation of 10% lactose solution

由圖3 可知，30 ℃/min 和40 ℃/min 的降溫曲線中，發現低溫轉變后熱流出現微弱反玻璃化趨勢，可能是由于降溫速率過高導致結晶不充分，從而升溫過程出現重結晶。

由圖3 可知，10%乳糖溶液在5 ℃/min～20 ℃/min 凍結速率條件下，玻璃化轉變溫度Tg′波動較小，10 ℃/min時最低，不同降溫速率時，玻璃化轉變溫度Tg′基本保持不變，與文獻[24]中的蔗糖溶液測試過程得到的結果相吻合。高于20 ℃/min 時，低溫轉變溫度呈下降趨勢，且降溫速率每高出10 ℃/min 時，Tg′降低1 ℃左右。5 ℃/min～30 ℃/min 速率降溫時，10 ℃/min 時Tg′最低，結合表1 過冷度表述，降溫速率小于30 ℃/min 時過冷度隨著降溫速率的增大而減小，且晶核的成核率降低，表明10 ℃/min 降溫時未凍水含量較大，玻璃化轉變程度較大，根據增塑作用，得出Tg′最低。

2.2 降溫速率對乳糖/水溶液凍干過程的影響

將10%乳糖溶液樣品從室溫（23 ℃～28 ℃）分別以5、10、20、30、40 ℃/min 降溫至-50 ℃，維持5 min 保證充分凍結，將冷熱臺腔體壓力調至10 Pa，然后以1 ℃/min 升溫干燥時，樣品塌陷狀況如圖4 所示。

圖4 10%乳糖溶液的不同降溫速率的凍干顯微圖Fig.4 Freeze-drying micrograph of a 10% lactose solution at different cooling rates

由圖4 可知，對比凍結過程的圖片無明顯變化。且40 ℃/min 降溫時的Tg′低于10 ℃/min 降溫時的Tg′，結合表1 數據可知降溫速率由30 ℃/min 增大至40 ℃/min時，過冷度變大，故成核率增大，不利于晶體生長，可見40 ℃/min 時的玻璃化程度更高。

分析干燥過程發現20 ℃/min 凍結時的干燥效果相對較好，塌陷和裂化現象都比較微弱；30 ℃/min 凍結時的凍干顯微圖未觀察到塌陷，但裂化現象比20 ℃/min降溫時嚴重，更好地證明了表1 結論中30 ℃/min 時過冷度最小、成核率低、晶體形態相對較大的結果，更有利于一次干燥過程中水分的升華，避免塌陷出現。對比圖4A 組和圖4B 組得出，降溫速率為10 ℃/min 時塌陷現象較嚴重，表明10 ℃/min 降溫時，玻璃化轉變程度更高，也表明過冷度低時成核率低，而玻璃態占比高；對比圖4B 組和圖4C 組，證明了表1 結論中20 ℃/min凍結時冰晶形態大于10 ℃/min 降溫時的研究結果，有利于水分升華，且玻璃化轉變溫度Tg′大；對比圖4D 組和圖4E 組，發現40 ℃/min 塌陷現象更嚴重，證明降溫速率大于30 ℃/min 時，形成的冰晶成核率較大，但是冰晶形態小，不利于水分的升華，導致較早出現塌陷現象，隨著溫度升高塌陷越嚴重。

圖5 為不同降溫速率條件下的玻璃化轉變溫度Tg′、塌陷溫度Tc和高溫轉變溫度THg的影響。

圖5 不同降溫速率對塌陷溫度的影響Fig.5 The influence of different cooling rates on collapse temperature

由圖5 可知，Tc在Tg′和THg之間，再次確定低溫轉變是玻璃化轉變過程。在5 ℃/min～40 ℃/min 降溫過程中，30 ℃/min 降溫時Tc與Tg′溫差最大，40 ℃/min 降溫時差值最小，表明在乳糖30 ℃/min 凍結時更有利于水分升華，在40 ℃/min 時玻璃化轉變程度最高，在升溫過程中會較早出現黏性流動產生的塌陷。

3 結論

本文通過差示掃描量熱法研究了不同降溫速率下乳糖/水二元溶液的坍塌現象和熱歷史的性質，研究發現：10%乳糖溶液在5 ℃/min～40 ℃/min 降溫速率下對Tg′波動影響較小，過冷度隨著降溫速率呈V 型趨勢，且在30 ℃/min 降溫時過冷度最低，樣品的結晶成核率最低，Tg′在5 ℃/min～20 ℃/min 降溫時呈V 型趨勢，10 ℃/min 最低，高于20 ℃/min 時Tg′呈下降趨勢，且每高出10 ℃/min 時Tg′約降低1 ℃，降溫速率對玻璃態的形成影響較小。乳糖/水二元溶液在凍干過程中，通過研究可知在20 ℃/min 和30 ℃/min 降溫過程中干燥效果最好，僅出現裂化現象，其他降溫速率條件下均有塌陷出現，表明在降溫過程中溶液的成核率降低，但冰晶生成形態相對較大，可以有效促進水分升華。