黑蒜多酚微波-超聲波協同提取工藝優化及其抗氧化研究

吳婷，劉思師，陳仲巍，曾穎，陳建福，陳雅欣，何若男1,※

（1.廈門醫學院，天然化妝品福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023；2.廈門醫學院藥學系，福建 廈門 361023；3.漳州職業技術學院食品工程學院，福建 漳州 363000）

黑蒜又稱為“發酵大蒜”，通常是以完整帶皮大蒜或大蒜新鮮碎顆粒為原材料，置于60～80℃、相對濕度70%～90%的高溫高濕環境下長時間發酵所得，該過程經美拉德反應形成類黑精等物質，使得大蒜逐步褐變。發酵醇熟后的黑蒜，在保留大蒜原有生物活性物質的同時，其氨基酸、類黑精、有機酸、多酚、含硫化合物和還原糖含量均有顯著增加，具有抗菌消炎、降血脂、增強免疫、降血糖[1]、保肝、抗腫瘤和保護心臟的生物活性[2]，同時還祛除了大蒜的辛辣口感，甜度增加，酸甜可口。因此，黑蒜作為一種新興的保健食品逐漸受到人們的喜愛，具有良好的市場前景。

本就作為食品多酚一項重要來源的大蒜，在發酵后其多酚含量增加數倍[3]，強還原力成為黑蒜最突出的特點。黑蒜的主要多酚類物質包括類黃酮、酚酸以及單寧，在其發酵加工過程中，多酚類物質在高溫高濕條件下被加熱水解為眾多酚類小分子物質，由此被釋放出的大量酚羥基大大提高了黑蒜的抗氧化性。Lu[4]等研究發現黑蒜比未加工的大蒜總酚含量高出7～11倍，總酚酸含量高出4～8倍，總黃酮含量高出1～5倍。王衛東等[5]報道黑蒜清除自由基的能力高出大蒜2倍，總還原能力高出大蒜的9倍。王首人等[6]發現在體外抗氧化活性方面，黑蒜比常規蒜高出9倍余。強倩等[7]報道黑蒜的還原能力與多酚含量呈正相關。LEE等[8]以數組糖尿病小鼠（3周齡）為樣本，7周內分別飼喂添加常規凍干大蒜和常規凍干黑蒜的飼料，發現飼喂黑蒜的樣本谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶以及超氧化物歧化酶活性升高顯著，黑蒜還原力強于常規大蒜4倍以上，結合其體外還原性測定結果，發現體內、體外實驗一致表明黑蒜具有較強的抗氧化性。

微波輔助萃取是近年發展推廣的一種新型技術，此法結合微波這一非電離的電磁輻射力和超聲波由劇烈機械效應和沖擊波對細胞產生的空化作用力，在破壞樣品的氫鍵及分子間作用力的同時提高傳質速率[9,10]，能夠以低廉成本快速提取產物。此外，微波輔助萃取方式也有助于樣品的溶質溶液在均勻受熱狀態下短時高效浸出細胞內容物，其與傳統提取方法超聲波法相輔相成可大幅提高提取效率，在性質不穩定的天然產物提取方面優勢尤為明顯[11]。此外，該法不存在傳統熱水浸提法低效率、易糊化及高耗能的缺點，相比于浸提法和回流提取法對環境無污染更高效，相比于酶法成本大幅降低，同時避免了酶易失活的缺點。本研究采用微波 超聲波協同提取方式，探索各因素對黑蒜果肉總多酚提得率的影響，以響應面法探索確定最佳條件，并對比鮮蒜進行抗氧化活性對比研究，為黑蒜果肉的資源開發研究提供參考和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

獨頭黑蒜（由山東軒逸食品有限公司提供，產自山東省濟寧市金山縣）；大蒜（產自山東省濟寧市）；沒食子酸、福林酚（北京索萊寶科技有限公司）；DPPH自由基[分析純，1,1-二苯基-2-苦肼基自由基，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司]；鄰苯三酚（西隴化工股份有限公司）；Tris（北京索萊寶科技有限公司）；水楊酸（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；L（+）-抗壞血酸（分析純，北京索萊寶科技有限公司A8100）。

粉碎機（廣州市旭朗機械設備有限公司XL-10B）；電子分析天平（sartorius BSA2202S-CW）；微波超聲波萃取儀（Xinyi-2A升級款）；臺式高速離心機[Sigma離心機（揚州）有限公司3K15]；酶標儀（BioTek EPOCH/2）；超低溫保存箱（青島海爾生物醫療股份有限公司DW-25L262）；pH計（EUTECH pH700）。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑蒜粉的制備 將去皮后的獨頭黑蒜切成薄片狀，置于電熱鼓風干燥箱，65℃條件下烘干至恒重后，放入萬能粉碎機粉碎并過180m（80目）篩，所得干物質放置于干燥器內避光密閉保存。

1.2.2 黑蒜多酚類物質提取方法 在預實驗的基礎上，稱取經預處理的黑蒜果肉粉末（1.00±0.05）g共3份分別放置于3個50 mL的錐形瓶內，常溫條件下（20℃）加入相應料液比的提取溶劑，采用超聲波-微波協同反應系統（恒定70℃）萃取，萃取后經5 000 r/min旋轉離心5 min分離留取上清液，以福林 酚比色法測定黑蒜多酚類物質含量。

1.2.3 總酚標準曲線的繪制及黑蒜果肉總酚含量測定 參考劉皓涵等[12]的方法，選用福林 酚比色法，略做修改。以0.2 mL為間隔等梯度取樣新鮮配制的標準工作液（100 mg/L的沒食子酸溶液）0～1.4 mL，測定吸光度值，以此繪制該標準曲線。以相同方法，精確移取適量的黑蒜萃取樣品液，測定記錄其吸光度后帶入標準公式計算得黑蒜萃取樣品溶液的總酚物質含量m。

上式中A為所測黑蒜樣液吸光度值；0.003 5為空白吸光度值；v為樣液體積，mL；d為樣液稀釋倍數；0.064 5為沒食子酸標準曲線的斜率。

1.2.4 黑蒜總酚超聲波 微波協同萃取單因素實驗參考1.2.2的實驗方法，分別在時間12 min，乙醇體積濃度（以下簡稱乙醇濃度）60%，溫度70℃[6]，超聲功率和微波功率均200 W條件下，設置5個液料比（乙醇/黑蒜果肉粉，mL/g）水平（0、20、30、40、50）；在液料比30:1，溫度70℃，乙醇濃度60%，超聲功率和微波功率均200 W條件下，設置5個提取時間（min）水平（6、8、10、12、14）；在液料比30:1、溫度70℃、乙醇濃度60%、時間12 min、超聲功率和微波功率均200 W條件下，設置5個乙醇濃度（%）水平（40、50、60、70、80）；在液料比30:1、溫度70℃、乙醇濃度60%、時間12 min和微波功率200 W條件下，設置5個超聲功率（W）水平（100、200、300、400、500）；在液料比30:1、溫度70℃、乙醇濃度60%、時間12 min和超聲功率200 W條件下，設置5個微波功率（W）水平（100、200、300、400、500）。3次重復，考察對黑蒜多酚提取量的影響。

1.2.5 響應面實驗 在單因素實驗的基礎上，選取對黑蒜果肉總多酚提取有顯著影響的微波功率、液料比、時間和提取液濃度4個因素，以黑蒜果肉總酚提得率為響應值來進行中心組合試驗設計，其水平編碼及試驗因素見表1。

表1 響應面設計因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.2.6 黑蒜體外抗氧化能力的測定 稱取等量的黑蒜和鮮蒜，按照同樣的方式進行總酚提取，并進行適當的梯度稀釋得到待測黑蒜和鮮蒜樣品。

1.2.6.1 黑蒜提取液對DPPH自由基的清除能力 參照song等[13]的方案略作改動，將精準配制的一系列濃度梯度新鮮大蒜、黑蒜的樣液裝入試管，取等量當日新鮮配制的DPPH溶液（0.2 mol/L）于暗處混合均勻，立即測定其在517 nm波長處的吸光值得A1，25℃避光恒溫反應40 min后測定得A0，對照組替換鮮蒜黑蒜樣液為去離子水得A2。以K1（%）表示DPPH清除率。

1.2.6.2 黑蒜提取液對羥自由基的清除能力 參考劉皓涵等[12]的方案略作改動，將精準配置的一系列濃度黑蒜和鮮蒜提取液分別與等量1.76 mM的FeSO4（新鮮配置）、等量1.76 mM水楊酸 乙醇（其以50%乙醇為溶劑）混合均勻，隨后加入等量1.76 mM的H2O2啟動反應，37℃避光恒溫反應30 min后，測定其于510 nm波長處的吸光值A'1。以鮮蒜/黑蒜樣液與3倍體積乙醇混合測吸光值得A'0，以蒸餾水替代鮮蒜/黑蒜樣液為空白對照A'2。以K2（%）表示羥自由基清除率。

1.2.6.3 黑蒜提取液對超氧陰離子的清除能力 參照左麗麗等[14]的方案略作改動，取25℃預熱的Tris-HCl（pH 8.2，50 mM）4.8 mL與鮮蒜/黑蒜的梯度樣液1 mL，以及2.5 mM的鄰苯三酚-HCl溶液0.4 mL（提前25℃預熱，以10 mM的HCl配制）混合，25℃恒溫反應4min后滴加數滴8 M的HCl以終止反應，在320 nm波長處測得吸光值A''1，鄰苯三酚-HCl溶液替換為無水乙醇得A''0，蒸餾水替換鮮蒜/黑蒜樣液為對照A''2。以K3（%）表示超氧陰離子清除率。

2 結果與分析

2.1 黑蒜總多酚提取單因素試驗

2.1.1 微波功率對黑蒜總多酚提得量的影響 由圖1看出，隨著微波功率增加，黑蒜果肉總多酚的提得率在微波功率達到300 W時出現峰值，為6.65 mg/g，隨后劇烈下降。這是由于微波破壞影響了部分氫鍵和分子間作用力，而隨著它進一步增強，會使得一些多酚物質被同步破壞[15]、提取溶劑揮發，進而致使提得量下降。因此，最適微波功率以300 W為宜。

圖1 微波功率對黑蒜果肉多酚提取量的影響Fig.1 Effects of microwave power on the extraction of polyphenols from black garlic

2.1.2 液料比對黑蒜總多酚提得量的影響 由圖2看出，隨著液料比的增加，黑蒜果肉總多酚的提得量有著早期迅速增高后期緩慢降低的趨勢，這是由于溶劑分子愈多，超聲波作用下傳質動力愈大，有助于多酚類物質的溶解浸出[16]。當液料比為40:1（mL/g）時，其提得量最高可達7.3 mg/g。當液料比超過40:1（mL/g）時，或許因其他溶解物的競爭性抑制致使提得率減少。故黑蒜多酚最適液料比以40:1（mL/g）為宜。

圖2液料比對黑蒜果肉多酚提取量的影響Fig.2 Effects of liquid-material ratio of polyphenols from black garlic

2.1.3 提取時間對黑蒜總多酚提得量的影響 由圖3看出隨著時間的增加，黑蒜果肉總多酚的提得量在協同萃取時間為11 min時達到峰值，最高達6.64 mg/g。其原理與2.1.1與2.1.5部分類似，當空化作用和微波輻射過強時，多酚類物質被破壞。

圖3 時間對黑蒜果肉多酚提取量的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction of polyphenols from black garlic

2.1.4 乙醇體積分數對黑蒜總多酚提得量的影響 由圖4看出隨著時間的增加，黑蒜果肉總多酚的提得量早期先顯著增高，或因溶質分子有助于其他溶質分子的溶出，進而有利于黑蒜果肉多酚類物質的浸出[17]，乙醇體積分數為50%時，其最高提得量達6.62 mg/g。

圖4 乙醇體積分數對黑蒜果肉多酚提取量的影響Fig.4 Effects of ethanol volume fraction on the extraction of polyphenols from black garlic

2.1.5 超聲功率對黑蒜總多酚提得量的影響 隨著超聲功率的增高，黑蒜總多酚的提得率呈現出了初期上升后期下降的趨勢，或因超聲波的機械和空化作用力破壞了黑蒜果實的細胞壁及細胞膜、細胞間質，促進胞內物質迅速溶出，當其超出200 W時，過強的作用力又促使酚類物質更多地發生聚合、氧化反應[15]，同步破壞了黑蒜果肉多酚類物質——諸如鄰二酚羥基等物質的結構[18]，降低了提得率。綜合實際效果與提取成本，選取超聲功率200 W為該提取液的最佳條件，其最高提得量達6.33 mg/g。

圖5 超聲波功率對黑蒜果肉多酚提取量的影響Fig.5 Effects of ultrasonic power on the extraction of polyphenols from black garlic

2.2 響應面優化黑蒜多酚提取試驗

2.2.1 響應面實驗 結合單因素實際結果和提取成本，將影響最小的超聲功率固定設置為200 W，固定提取溫度70℃，選用料液比、微波功率、時間和乙醇體積分數為自變量，以黑蒜總多酚提得量（率）為響應值進行優化。試驗方案和結果分析見表2。采用Design-Expert 12.0軟件對表2進行響應面回歸分析，獲得黑蒜總多酚提得率為響應值的二次多項回歸模型為：Y=8.43+0.276 6A+0.359 0B+0.535 9C+0.539 0D-0.019 7AB-0.009 9AC-0.033 8AD+0.022 9BC+0.070 3BD-0.065 5CD-0.866 8A2-0.700 1B2-1.03C2-0.839 9D2，由此可知二次項系數皆為負數，拋物線開口朝下，擁有極大值點。方差分析結果見表3：模型回歸為極顯著（P＜0.000 1），失擬項為不顯著（P＞0.05），表明外界其余因素對試驗結果干擾不顯著。模型的決定系數為R2=0.983 4，表明回歸方程與實際測試所得數據能夠良好吻合，可以良好反映出黑蒜果肉多酚提得量與液料比、微波功率、乙醇體積分數與時間的關系。同時可知，各因素對萃得率的影響大小為：D＞C＞B＞A，且一次項（A、B、C、D）和二次項（A2、B2、C2、D2）對萃得率有極顯著影響（即P＜0.01）；交互項BD萃得率有顯著影響（即P＜0.05），交互項CD對萃得率有較顯著影響。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 experimental designs and results of Box-Behnken

表3 回歸模型方差分析Table 3 The variance analysis of the regression model

2.2.2 響應面圖分析 根據2.2.1中回歸方程制作的黑蒜多酚提取模型響應面立體分析圖和等高線圖見圖6和圖7。圖6和圖7分別反映了4個因素（液料比、微波功率、萃取時間、乙醇體積分數）兩兩交互作用下對響應值的影響，等高線形似圓形坡度平緩表明兩因素之間交互作用不明顯，形似橢圓形坡度陡峭、排列緊密則表示二因素之間的交互作用明顯[19]。其中，料液比和微波功率之間交互作用較明顯。由圖6與圖7可得，乙醇體積分數和萃取微波功率、時間和料液比為0水平時，隨著各水平因素的變化黑蒜多酚提得量呈現出先增大后減小的趨勢。由等高線圖可知，料液比與萃取時間、料液比與微波功率的響應面相對更為陡峭，同時等高線狀似橢圓，說明二者間的交互作用較為強烈[19]，與黑蒜總多酚萃得率的影響極顯著；乙醇體積分數與萃取時間的響應面最為平緩，等高線也形狀最近似圓形，說明交互作用相對較小。此結論與表3所示結果一致。

圖6 三維面圖和等高線圖Fig.6 The three-dimensional surface diagram and contour diagram

圖7 三維面圖和等高線圖Fig.7 The three-dimensional surface diagram and contour diagram

2.2.3 驗證試驗 對優化后的黑蒜多酚提取方程求解，得出試驗分為內最佳條件：乙醇水平分數51.485%、微波功率327.457 W、萃取時間為11.759 min、液料比43.2:1（mL/g）；實際試驗條件下最佳提取工藝為：乙醇水平分數5 1.5%、微波功率3 3 0 W、萃取時間為12 mi n、液料比43:1（mL/g）。重復3次試驗，黑蒜多酚平均提得量為8.66 mg/g，與預測值基本擬合，表明該優化模型可靠。

2.3 黑蒜/鮮蒜提取物體外抗氧化性活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 如圖8所示，黑蒜和鮮蒜兩種蒜樣品均具備DPPH自由基清除能力，且其清除力強弱與提取液濃度呈顯著正相關。其中黑蒜樣品的上升幅度更為明顯，在相同樣品濃度下，黑蒜提取液的體外DPPH自由基清除能力最高可達鮮蒜近十倍。在總酚質量濃度均為4g/mL時，黑蒜的總酚提取物體外對羥基清除率可高達鮮蒜的5倍，分別為23.86%和4.3%。在總酚質量濃度為12g/mL時，黑蒜的總酚提取物體外對羥基清除率可高達鮮蒜的9倍余，分別為87.3%和9%。這可能與黑蒜果在高溫高濕環境下多酚類物質被分解為更多的小分子酚類有關。

圖8 鮮大蒜與黑蒜果肉總多酚提取物對DPPH自由基清除能力對比Fig.8 The scavenging ability of fresh garlic extract and black garlic extract on DPPH free radical

2.3.2 羥基自由基清除能力 如圖9所示，羥自由基清除能力也伴隨著黑蒜和鮮大蒜樣品濃度的增加而明顯提升。在總酚質量濃度均為60g/mL時，黑蒜的總酚提取物體外對OH可高達鮮大蒜的近8倍，分別為88.2%和11.6%。這或許與黑蒜發酵過程中產生了部分具有強自由基清除能力的生物活性分子（如水溶性硒蛋白）[20]，抑制了DPPH這一親水基團造成的氧化反應有關。

圖9 鮮大蒜與黑蒜總酚提取物對羥自由基的清除能力比較Fig.9 The scavenging ability of the fresh garlic extract and the black garlic extract on hydroxy free radical

2.3.3 超氧陰離子清除能力 如圖所示，超氧陰離子的清除力百分比也與2種蒜品提取液質量濃度顯著呈正相關。在總酚質量濃度均為30g/mL時，黑蒜的總酚提取物體外對羥基清除率可高達鮮蒜的3倍余，分別為29%和7.3%。在總酚質量濃度均為60g/mL時，黑蒜的總酚提取物體外對羥基清除率可高達鮮蒜的2倍，分別為49%和22.3%。在質量濃度為40g/mL附近時清除力百分比增長明顯放緩，這或許與硒元素[21]的量增加放緩有關。

圖10 鮮大蒜與黑蒜總酚提取物對超氧陰離子自由基清除能力比較Fig.10 The scavenging ability of the fresh garlic extract and the black garlic extract on superoxide anion free radical

3 結論

3.1 本研究采用微波 超聲波協同萃取法，以乙醇為提取溶劑探索超聲功率、微波功率、時間、乙醇體積分數和料液比5個因素作為自變量時對黑蒜果肉多酚提得率的影響，其中其影響順序為料液比＞時間＞微波功率＞乙醇體積分數＞超聲功率。隨后采用響應面法優化黑蒜果肉中多酚提得率，獲知最佳工藝參數為，在溫度為70℃，超聲功率200 W時，微波功率330 W、液料比43:1（mL/g）、時間11.8 min、乙醇體積分數51.5%、在該條件下多酚提取率為8.66 mg/g，與預測值接近，表明此模型能夠用于黑蒜果肉多酚提取工藝優化。

3.2 通過對黑蒜果肉和鮮大蒜中總酚提取物的體外抗氧化能力測定表明，黑蒜果的DPPH自由基清除率、超氧陰離子清除率以及羥自由基清除率均顯著優于鮮大蒜，因而黑蒜更加適用于藥品與保健品的開發利用。