肉桂精油的化學成分分析及其對沙門氏菌細胞膜損傷機制的研究

陳雪琴，趙圓圓，張珍*，吳佩君，李雯，杜建明，張生祥，王鵬，王麗

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(蘭州市西固區市場監督管理局，甘肅 蘭州，730060)

隨著全球人口的迅速增長，人們對于食物的需求量大幅增加，越來越多的食品安全問題被推上風口浪尖，因此食品安全問題已經成為當今社會所面臨的重要挑戰之一。世界衛生組織(World Health Organization，WHO)報告顯示，沙門氏菌(Salmonellaenterica)位于食源性致病菌的前列，全球大部分地區都存在著不同程度的S.enterica污染問題，這嚴重威脅到公眾健康，并導致嚴重的經濟損失[1]。S.enterica屬于腸道菌科，廣泛存在于自然界中，是一種有鞭毛，無芽孢，經染色后呈紅色的革蘭氏陰性微生物，大多數S.enterica能引起傷寒、副傷寒以及食物中毒等，其可導致敗血癥、胃腸炎和腸熱癥三類疾病，且都是通過食物傳播引起的，其中動物性食品占大部分[2]。雖然化學防腐劑被廣泛開發使用，但卻給人類身體健康帶來較大的危害，因此選擇開發綠色天然的抑菌物質具有重要意義。

目前，香辛料精油已被廣泛用于食品的防腐保鮮。我國的植物資源豐富，這為植物精油的開發和利用提供了有利條件。植物精油是一種從植物的分泌組織中提取的具有一定生物活性的揮發性油狀物質，其成分復雜，由幾十種至數百種化合物組成[3]。研究表明植物精油對幾種重要的食源性致病菌(S.enterica、單核細胞增生李斯特菌、彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7等)均有明顯的抑制作用[4]。肉桂是雙子葉樟科植物，其皮、葉等各種組織中含有大量的揮發油、黃烷醇、多酚、香豆素、木質素、黃酮等。肉桂精油(cinnamon essential oil，CEO)是從肉桂皮、肉桂葉等中提取出來的，為黃色油狀、無毒且易揮發，研究表明CEO的主要成分肉桂醛具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[5]。趙露露等[6]研究表明CEO對S.enterica具有良好的抗菌作用。呂飛等[7]研究表明CEO對腐敗希瓦氏菌的細胞膜具有較強的破壞作用。同時王芳等[8]研究也發現CEO能夠改變成團泛菌和腐生葡萄球菌細胞膜的通透性和完整性。然而目前有關CEO對S.enterica細胞膜損傷機制的研究鮮有報道。

因此，本實驗以S.enterica為供試菌株，基于液體培養和平板培養體系，擬采用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色和掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)技術觀察、結合一系列生理生化指標的測定，從細胞膜結構、膜通透性等方面探討CEO對S.enterica細胞膜的影響，以期闡明CEO對S.enterica的抑菌機理，為開發安全、高效的S.enterica抑制劑提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料：肉桂，百味福食品有限公司。

供試菌株：沙門氏菌(Salmonellaenterica)，本實驗室分離保存菌種。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理及CEO和肉桂醛提取

稱取適量肉桂皮放入粉碎機粉碎，然后過40目篩，收集粉末備用。CEO提取參照徐紅艷等[9]方法進行。肉桂醛提取參照姚杭村等[10]方法進行。

1.2.2 CEO成分分析

具體分析參照張鳳蘭等[11]方法進行。本實驗通過GC-MS進行CEO的化學成分分析，具體條件和儀器設置參數如下：(1)氣相色譜條件：色譜柱DB-17MS(30 m×250 mm，0.25 μm)；程序設置：初始溫度為50 ℃，1 min，先升溫至220 ℃(4 ℃/min)，保持8 min，繼續升溫至250 ℃(20 ℃/min)，保持2 min。進樣溫度為250 ℃，氦氣載氣，柱流量設置為1.0 mL/min，分流方式進樣，分流比為250∶1；(2)質譜條件：進樣方式為電子轟擊(electron impact，EI)離子源，電子能量為70 eV，離子源溫度為250 ℃，接口溫度為230 ℃，相對分子質量掃描范圍：15～500 u。

1.2.3 CEO抑菌活性的評價

1.2.3.1 菌懸液的制備

將S.enterica活化后，用無菌接種環挑取單個菌落接種于NB培養基中，37 ℃，150 r/min振動培養過夜，菌懸液濃度調整為1×106CFU/mL，備用[12]。

1.2.3.2 CEO和肉桂醛抑菌效果的測定

參照孫長花等[12]方法進行測定。利用牛津杯法測定CEO和肉桂醛對S.enterica的抑菌圈直徑。吸取200 μL的菌懸液均勻涂布于NA培養基表面，然后垂直擺放4個無菌牛津杯，第一組加無菌水對照(CK)和CEO 100 μL；第二組加無菌水對照(CK)和肉桂醛單體55 μL；第三組加無菌水對照(CK)、CEO 100 μL和肉桂醛55 μL，經培養24 h觀察菌體生長情況，然后用游標卡尺測量抑菌圈直徑大小，觀察并記錄數據。

1.2.3.3 最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)的測定

參照羅飛亞等[13]方法進行測定。將CEO用1%的吐溫80水溶液稀釋成13.8%(體積分數)的溶液。取9個無菌試管，標記為1～9號，1～8號為添加CEO組，9號試管作為對照組，1～8號試管中分別加入1 mL NB培養基，在1號試管中添加1 mL的CEO溶液搖勻后從1號試管取1 mL至2號試管，以此類推，從8號試管中取出1 mL棄去。然后在每支試管中添加1 mL菌懸液，使得CEO最終體積分數為0.012 5%、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%和1.6%，充分混勻后分別從各試管內吸出100 μL均勻涂布在NA培養基上，在37 ℃恒溫培養箱中培養12 h，觀察并記錄MIC。繼續培養12 h，然后肉眼觀察，記錄MBC。生長菌體為陽性(+)，不生長菌體為陰性(-)，把不長菌的最小CEO濃度作為MIC和MBC，實驗重復3次，結果取平均值。

1.2.3.4 生長曲線的測定

參照ZENG等[14]方法進行測定。向NB培養基中加入菌懸液使OD600nm=0.2。然后加入不同濃度(1/2 MIC、MIC)CEO。同時設置對照組。在37 ℃、150 r/min 的搖床中分別培養0、2、4、6、8、10、12 h時測定OD600nm值。以時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，繪制出CEO作用于S.enterica的生長曲線圖，實驗重復3次，結果取平均值。

1.2.3.5 殘存菌數的測定

參照ZENGIN等[15]方法進行測定。本實驗采用平板菌落計數法測定CEO對S.enterica的抗菌活性，將接種至NB培養基中的S.enterica于37 ℃下培養至對數生長期備用，使用PBS將菌液濃度稀釋至1×106～107CFU/mL，然后加入不同濃度(1/2MBC、MBC)CEO，同時設置對照組，充分混勻后放置在37 ℃搖床中振蕩培養，分別在0、2、4、6、8 h時吸取100 μL菌懸液涂布在NA培養基上，恒溫培養24 h后對每個時段的殘存菌數進行計數，實驗重復3次，結果取平均值。

1.2.4 CEO對S.enterica細胞膜滲透性的影響

核酸泄漏量參照ZHANG等[16]方法測定。將過夜培養的S.enterica在5 000 r/min離心8 min，再懸浮在PBS中。在500 μL的PBS懸液中加入不同濃度(1/2 MIC、MIC)CEO，同時設置對照組。所有樣品均在37 ℃下培養取上清液，測定OD260nm值，每2 h測定1次，持續8 h，實驗重復3次，結果取平均值。

相對電導率參照藍蔚青等[17]方法測定。過夜培養的菌液在5 000 r/min離心8 min。用5%葡萄糖洗滌沉淀作為等滲細菌溶液。然后，將不同濃度(1/2 MIC、MIC)CEO加入到5%的葡萄糖溶液中，使用電導率儀測量電導率記為L1。同時，在等滲細菌溶液中加入不同濃度(1/2 MIC、MIC)CEO，每隔2 h測定電導率記為L2，持續8 h。同時設置對照組，L0代表等滲S.enterica溶液在沸水中處理5 min后測得的電導率。實驗重復3次，結果取平均值。采用公式(1)計算相對電導率：

(1)

1.2.5S.enterica細胞內超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活力以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定

SOD、CAT和MDA參照南京建成賽浩科技有限公司試劑盒方法進行測定。

1.2.6 CEO對S.enterica細胞膜完整性和微觀結構的影響

細胞膜完整性采用PI染色檢測，具體參照NOVO等[18]方法測定。在NB培養基中加入不同濃度(1/2 MIC、MIC、2 MIC)的CEO，同時設置對照組。過夜培養的S.enterica在5 000 r/min離心8 min，然后用PBS洗滌3次，重懸。將樣品(包括5 μL PI染色液和95 μL菌液)置于37 ℃黑暗中染色30 min。離心棄上清液，然后PBS清洗3次，將染色好的菌液滴至載玻片上，用蓋玻片覆蓋，熒光顯微鏡觀察拍照。

微觀結構參照李云祥等[19]方法進行測定。挑取單個菌落在37 ℃，150 r/min的搖床中過夜培養。取2 mL菌懸液，加入不同濃度(1/2 MIC、MIC、2 MIC)CEO，并設置對照。37 ℃，150 r/min處理5 h，以5 000 r/min離心8 min，PBS洗滌3次，然后將S.enterica溶解在2.5%的戊二醛溶液中4 ℃下固定過夜，抽干固定劑，PBS清洗3次。然后使用不同體積分數(30%、50%、70%、80%、90%、95%)的乙醇對樣品進行脫水15 min。最后，樣品在乙酸異戊酯中置換30 min，最后將干燥后的菌體通過噴金處理后，使用SEM進行觀察。

1.3 數據分析

所有數據均采用Microsoft Excel 2013進行數據處理；使用SPSS Statistics 25.0軟件對數據進行顯著性分析(P<0.05)；通過Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 CEO的化學成分

GC-MS分析表明CEO主要含38種化學成分(表1)，包括單萜烯類、倍半萜烯類及其含氧衍生物和少量的酯。其中反式肉桂醛相對含量較高，為55.00%，其余組分分別為(-)-α-蓽澄茄油烯(13.28%)、δ-卡丁烯(9.39%)、α-衣蘭油烯(5.22%)、γ-茂丁烯(2.11%)、小茴香酚(1.61%)和枯茗醛(1.24%)等，占總成分的87.85%。因此，CEO可能是通過多種化學成分的協同來發揮抗菌作用的。

表1 肉桂精油揮發性成分Table 1 Volatilecomponents of cinnamon essential oil

2.2 CEO和肉桂醛對S.enterica抑菌活性的研究

2.2.1 CEO和肉桂醛對S.enterica的抑菌效果

如圖1所示，采用牛津杯法實驗，從抑菌實驗照片可以清晰看出，CEO和肉桂醛單體對S.enterica生長均具有明顯的抑制作用，對照組對S.enterica沒有抑菌作用，CEO的抑菌圈[(21.0±0.20) mm]更大，這說明除肉桂醛單體對S.enterica有抑制作用外，CEO的其他成分也有一定的抑制作用，但是作為CEO特征成分肉桂醛的貢獻最大[(15.0±0.30)mm]。

a-CEO處理；b-肉桂醛處理；c-CEO和肉桂醛處理圖1 CEO和肉桂醛對S.enterica抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect of CEO and cinnamaldehyde on S.enterica

2.2.2 MIC、MBC的測定

采用二倍稀釋法，分別進行涂布抑菌實驗。通過平皿中菌落生長情況來判定MIC和MBC，如表2所示，當CEO體積分數≥0.1%時，均未見菌落生長，而當CEO體積分數≤0.05%時，平皿上出現菌落。由此得出CEO對S.enterica的MIC和MBC均為0.1%。表明CEO對S.enterica的抑菌效果良好。

表2 MIC值和MBC值Table 2 MIC and MBC values

2.2.3 生長曲線的測定

由于OD值與菌液濃度成正比，因此測定菌液OD值隨時間變化的規律可以間接反應菌液濃度隨時間變化的規律。如圖2所示，對照組OD值2 h時開始升高，12 h時達到1.922，菌液濃度明顯增加，表現為典型的“S”型，該時間段為菌群的對數生長期。在1/2 MIC處理組中，發現OD值略低于對照組，表明CEO處理有效延遲了菌群對數期的到來，但此過程在緩慢生長一段時間后，仍然會達到相應菌液濃度，然而在整個測定時間內MIC處理組的OD值未發生明顯變化，說明該處理能夠明顯抑制S.enterica對數生長期的分裂和繁殖，使其無法達到正常的生長高峰。由此可知，CEO對S.enterica具有良好的抑制作用，并且隨CEO濃度的增加而增強。

圖2 CEO對S.enterica生長曲線的影響Fig.2 Effect of CEO on the growth curves of S.enterica

2.2.4 殘存菌數的測定

圖3 CEO作用于S.enterica不同時間點的殘存菌數Fig.3 Time-dependent killing assay of CEO against S.enterica注：*表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 CEO對S.enterica細胞膜通透性的影響

2.3.1 CEO對S.enterica核酸泄漏量的影響

細胞膜是細菌的第二道屏障，當細胞膜遭到破壞時，不僅會造成胞內小分子物質的泄漏，還會導致胞內DNA、RNA等大分子物質的泄漏。核酸大分子物質存在于細胞膜和細胞質之間，是菌體進行生理代謝必不可少的生物大分子。核酸在260 nm處具有最大紫外吸收值，并且吸光值與核酸濃度成正比[20]。因此，本研究通過測定260 nm處的光密度來分析細胞膜的受損程度，進而推測細胞膜的完整性。如圖4所示，隨著培養時間的延長，處理組的吸光值顯著高于對照組(P<0.05)，其中1/2 MIC和MIC處理組在培養過程中吸光值均迅速上升，分別從0.042和0.041增加到0.145和0.336，而對照組則無明顯變化。由此可見，CEO作用于S.enterica后，其細胞膜通透性發生了變化，核酸泄漏，影響了S.enterica的正常生長繁殖。因此CEO對S.enterica細胞膜具有一定的破壞作用，且破壞程度呈現CEO濃度依賴性，即濃度越高，破壞程度越大。

圖4 CEO處理S.enterica核酸泄漏情況Fig.4 Release of nucleic acids from S.enterica following treatment with CEO

2.3.2 相對電導率的測定

細胞膜作為細菌細胞分泌、排泄、物質交換等生理功能的重要結構，其膜結構雖然較小，但其發生變化會使菌體保護屏障被打破，導致細胞膜通透性增加，細胞內小分子電解質泄漏出來，電導率上升，從而導致細胞代謝活動紊亂，引起菌體死亡[21]。本實驗通過測定菌液相對電導率的變化來觀察細胞膜通透性的變化情況。如圖5所示，在整個培養時間內，處理組菌懸液的相對電導率顯著高于對照組(P<0.05)。0 h時，處理組和對照組的相對電導率接近，這說明處理組培養液中的CEO和對照組中的去離子水相對電導率基本相近，因此可以排除由于液體成分的差異造成的影響；6 h時，1/2 MIC和MIC處理組菌懸液的相對電導率分別顯著增加至34.97%和43.15%；繼續培養至8 h時，其相對電導率基本不變，推測可能是由于CEO在培養前期發揮了較大作用，從而導致S.enterica細胞膜發生破裂。該結果與核酸泄漏量測定結果一致，因此可以推測，CEO破壞了S.enterica的細胞膜，導致細胞膜通透性增加，細胞內大量小分子物質泄漏，從而影響菌體細胞的正常代謝活動。

2.4 S.enterica細胞內SOD、CAT活性以及MDA含量測定

2.4.1S.enterica的SOD活性

SOD是菌體內重要的保護酶之一，對機體的氧化與抗氧化平衡具有重要作用，其可以清除超氧陰離子自由基(·O2-)，提高菌體對活性氧的耐受力，從而保護菌體細胞免遭損傷。因此，SOD活力的高低能夠間接反映機體清除氧自由基的能力[22]。結果表明，S.enterica經不同濃度CEO處理2 h后，SOD活力均出現不同程度的下降，4 h時，SOD活力快速上升，且CEO濃度越高，上升幅度越大。其中，MIC處理組4 h時SOD活力達到最大，為149.16 U/mgprot；8 h時，SOD活力明顯下降，且CEO濃度越高，SOD活力下降越顯著(P<0.05)，而對照組則未發生明顯變化(圖6)。因此表明，CEO處理對S.enterica的SOD活力具有明顯的影響，SOD活力降低，說明其對S.enterica自身的保護性下降，容易受到自由基的攻擊而自溶。

圖5 CEO對S.enterica細胞膜通透性的影響Fig.5 Effect of CEO on cell membrane permeability of S.enterica

圖6 CEO處理對S.enterica菌體SOD活性影響Fig.6 Effect on the enzyme activity of SOD in S.enterica by CEO

2.4.2S.enterica的CAT活性

CAT是菌體內清除活性氧的重要保護酶之一，可使機體內H2O2發生歧化反應生成H2O和O2，從而使菌體細胞免遭H2O2的破壞[23]。如圖7所示，S.enterica經不同濃度CEO處理4 h后，S.enterica的CAT活力呈現顯著上升的趨勢(P<0.05)，且均在4 h 時達到最大值，為87.37 U/mg prot和97.74 U/mg prot；8 h時，處理組CAT活力顯著下降，且CEO濃度越高，下降越明顯，而對照組無明顯變化。以上結果表明，CEO逆境脅迫對S.enterica的CAT活性具有明顯的影響。前期CAT活力提高是為保護菌體，但后期菌體衰老，代謝強度降低，CAT活性下降，清除H2O2和活性氧的能力減弱，蛋白質變性和膜脂過氧化程度嚴重。

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圖7 CEO處理對S.enterica菌體CAT活力影響Fig.7 Effect on the enzyme activity of CAT in S.enterica by CEO

2.4.3S.enterica的MDA含量

MDA是膜脂過氧化作用的終極產物，可作為衡量機體脂質過氧化及細胞損傷程度的一個重要標志。機體產生的氧自由基不僅可以攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)引發細胞膜脂質過氧化反應，而且還能通過脂質過氧化物的分解產物(MDA)引起細胞損傷，進一步使細胞膜的脆性增加，流動性和通透性發生改變。本實驗采用硫代巴比妥酸(thibabituric acid，TBA)顯色法測定細胞內的MDA含量。如圖8所示，不同濃度CEO處理2 h后，S.enterica的MDA含量均顯著提高；4 h時MDA含量增速變緩，可能是由于前期CEO的加入導致自由基的積累，膜脂受到自由基的攻擊，使得MDA含量增加，隨著CEO誘導時間的延長，SOD活力增加，大量自由基被清除，因此MDA變化趨于平緩；8 h時，1/2 MIC和MIC處理組MDA含量均顯著升高，分別為1.93、3.51 nmol/mg prot，且CEO濃度越大，MDA含量升高越顯著(P<0.05)，對照組則始終趨于平穩狀態，約為0.70 nmol/mg prot。這一結果表明CEO能夠通過抑制S.enterica細胞內抗氧化酶的活性，提高MDA含量。

圖8 CEO處理對S.enterica菌體MDA含量的影響Fig.8 Effect on the concent of MDA in S.enterica by CEO

2.5 CEO對S.enterica細胞膜完整性和微觀結構的影響分析

2.5.1 PI檢測CEO對S.enterica細胞膜完整性的影響

基于前面的研究發現，CEO能夠導致S.enterica細胞膜通透性改變，因此通過PI染色技術進一步觀察其對S.enterica細胞膜完整性的影響。PI是一種核酸熒光探針，它只能穿透受損的細胞膜與DNA結合呈紅色。正常情況下，菌體的細胞膜結構完整，PI染料無法對菌核進行染色，在熒光顯微鏡下觀察不到熒光。而當細胞膜發生破損時，很多原本不能透過細胞膜的物質便可自由穿過，PI進入細胞和DNA發生結合，同時，通過特定激發波長即可在熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光[24]。因此，檢測PI對細胞的染色情況可以間接反映CEO對細胞膜完整性的影響。如圖9所示，對照組幾乎未觀察到紅色熒光，表明無明顯壞死的S.enterica細胞；1/2 MIC處理組出現少部分紅色熒光，MIC處理組出現大部分紅色熒光，2 MIC處理后出現大面積紅色熒光，因此表明，CEO處理后S.enterica細胞膜完整性遭到破壞，且CEO濃度越高，完整性破壞作用越明顯。

a-對照；b-1/2 MIC；c-MIC；d-2MIC圖9 熒光顯微鏡觀察CEO作用S.enterica細胞Fig.9 S.enterica treated with CEO were observed by fluorescence microscope

2.5.2 CEO對S.enterica微觀結構的影響

采用SEM技術可以較為直觀地反映出CEO處理前后菌體形態結構的變化，以此判斷S.enterica的受損情況。如圖10所示，對照組細胞表面較為光滑平整，外觀飽滿，無缺損，且呈典型的桿狀結構，表明菌體結構完整，生長狀態良好。而經CEO處理4 h后，菌體經歷了明顯的形態變化，細胞呈現不同程度的皺縮、破裂，且細胞間界限模糊。其中MIC處理組菌體表面粗糙、形狀扭曲，而2 MIC處理組在形狀扭曲的基礎上，部分細胞還相互黏結，形態破壞更為明顯。結果表明CEO會破壞S.enterica的細胞結構，該結果與CEO對細胞膜通透性實驗結果一致。

a-對照；b-1/2MIC；c-MIC；d-2MIC圖10 CEO對S.enterica形態結構的影響Fig.10 Effect of CEO on morphological structure of the S.enterica

3 討論

本實驗通過對S.enterica微觀結構以及細胞膜通透性等方面的研究，初步探討了CEO對S.enterica的抑菌機制。通過GC-MS分析得到CEO的主要成分為反式肉桂醛。抑菌實驗表明，CEO對S.enterica具有明顯的抑制作用且存在明顯的濃度依賴性，同時通過SEM觀察發現CEO能夠破壞S.enterica的細胞結構，引起細胞受損，使得菌體無法快速恢復，從而使胞內物質發生泄漏，導致菌體形態發生明顯改變，這可能是CEO抑制S.enterica菌體生長的主要原因[25]。這與王芳等[8]發現CEO對成團泛菌和腐生葡萄球菌生長具有抑制作用的結果一致。

在研究CEO對S.enterica的抗菌機理時，首先考慮的是CEO如何突破S.enterica細胞膜的防御體系。本研究結果表明CEO處理改變了S.enterica細胞膜的通透性，從而使得核酸和小分子電解質不斷從胞內外泄。MIC處理組中，S.enterica的細胞膜遭到破壞，通透性增大，小分子物質和核酸的泄漏量增多，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，該現象說明CEO可作用在細胞內部，打破正常生理活動，從而使S.enterica生長受到抑制。本結果與侯偉峰等[26]的實驗結果一致，可以推測CEO的作用靶點是菌體細胞膜，使細胞不能維持正常的生理代謝活動，從而引起S.enterica死亡。

4 結論

綜合微觀結構、細胞膜通透性等方面的研究，推測CEO對S.enterica的抑菌機理是通過誘導活性氧在胞內的積累，引起氧化脅迫反應，從而導致細胞膜的完整性喪失，最終使菌體生長受到抑制。