液相色譜-單四級(jí)桿法檢測(cè)奶粉中泛酸的應(yīng)用

徐 旖，王榮艷，陳青俊，任一平

1 浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江杭州 310051

2 浙江清華長(zhǎng)三角研究院，浙江嘉興 314000

0 引言

泛酸又稱為維生素B5，是一種水溶性維生素，外觀顏色呈淺黃，因廣泛存在于動(dòng)植物中而得“泛酸”之名（圖1）。泛酸的一個(gè)重要作用是以乙酰輔酶A形式參加代謝過(guò)程，是二碳單位的載體，也是體內(nèi)乙酰化酶的輔酶，是酰基的傳遞者。我國(guó)對(duì)奶粉中的泛酸使用量有一定的標(biāo)準(zhǔn)要求，為6~80 mg/kg[1]，特殊醫(yī)學(xué)食品中對(duì)泛酸使用量也有要求[2]，因此為了保證奶粉的質(zhì)量，必須加強(qiáng)泛酸含量的檢測(cè)。

圖1 泛酸結(jié)構(gòu)式

目前，食品中泛酸的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法是微生物法和高效液相色譜法[3]。微生物法[4，5]是測(cè)定泛酸的經(jīng)典方法，但操作復(fù)雜且費(fèi)時(shí)，屬于半定量方法。高效液相色譜法[6~12]常用于強(qiáng)化食品中泛酸的檢測(cè)，其流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖溶液，需精準(zhǔn)地調(diào)節(jié)溶液pH值，不但過(guò)程復(fù)雜，且200 nm檢測(cè)波長(zhǎng)易受到其他營(yíng)養(yǎng)添加劑的干擾；隨著水解乳清蛋白原料在嬰幼兒食品中的開(kāi)發(fā)利用，高效液相法測(cè)試泛酸的預(yù)處理過(guò)程中，水解的蛋白肽無(wú)法被硫酸鋅沉淀去除，色譜柱的分離能力有限，使現(xiàn)行國(guó)標(biāo)[3]在測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)配方和基質(zhì)復(fù)雜樣品時(shí)常常遇到雜質(zhì)色譜峰干擾的問(wèn)題（圖2），因此該標(biāo)準(zhǔn)方法面臨修訂的需求。此外，免疫法、高效毛細(xì)管電泳法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、超臨界流體色譜法等[13~17]由于儀器價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜而難以普及。

圖2 液相色譜法-色譜峰干擾圖

液相色譜-單四級(jí)桿檢測(cè)法具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的排除干擾能力，可快速測(cè)定較低含量且基質(zhì)復(fù)雜的樣品，具有操作簡(jiǎn)單、儀器價(jià)格相對(duì)低的優(yōu)點(diǎn)。本文采用泛酸-[13C6，15N2]作為泛酸分析的內(nèi)標(biāo)物，液相色譜-單四級(jí)桿（色譜）聯(lián)用Arc-QDA系統(tǒng)，HSS T3反相色譜柱分離，單四級(jí)桿檢測(cè)器，有效排除了液相色譜-紫外檢測(cè)器方法測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)配方樣品存在的色譜峰干擾問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泛酸鈣（純度≥99.0%），Sigma公司；泛酸-[13C6，15N2]（純度99.4%），Be Pure公司；甲酸（色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸銨（色譜純）、水系濾膜0.22 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

四元梯度高壓液相-單四級(jí)桿（色譜）聯(lián)用儀、Acquity HSS T3色譜柱 Waters公司；3K15型高速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；ST 3100型pH計(jì)、AR224CN型電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制

泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）：稱取泛酸鈣10.78 mg，加水溶解至100 mL容量瓶，4 ℃保存。

泛酸同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 μg/mL）：稱取泛酸-[13C6，15N2] 5 mg，加水溶解至100 mL容量瓶，4 ℃保存。

1.3.2 樣品處理

稱取樣品約5 g（精確至0.001 g）至100 mL錐形瓶中，加25 mL溫水溶解，加入3 mL同位素內(nèi)標(biāo)溶液。如果試樣中含有淀粉，加入淀粉酶0.2 g，振搖混勻，蓋上瓶塞，在（55±5）℃水浴條件下，振搖酶解120~240 min；如果試樣不含淀粉，直接超聲15 min。放置室溫，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至5.0±0.1，加入5 mL硫酸鋅溶液，混勻。轉(zhuǎn)入50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度并充分混勻后，轉(zhuǎn)入2 mL離心管15 000 r/min離心5~10 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜。吸取0.5 mL濾液用水稀釋并定容至5 mL容量瓶，待上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL。流動(dòng)相A：10 mmol/L甲酸銨（含0.5%甲酸）溶液，流動(dòng)相B：甲醇。梯度洗脫條件：0~1 min，95%A；1~4 min，5%~100%B；4~5 min，100%B；5.1~10 min，95%A。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電離模式：ESI+；監(jiān)測(cè)方式：?jiǎn)坞x子選擇（SIR）；毛細(xì)管電壓：800 V；離子源溫度：122 ℃；噴針溫度：600 ℃；質(zhì)譜監(jiān)測(cè)條件見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜檢測(cè)條件

1.4 結(jié)果計(jì)算

試樣中泛酸含量計(jì)算公式如下：

式中：X為泛酸含量（mg/100 g）；c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的泛酸濃度（μg/mL）；V為樣品定容體積（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

本方法比較了C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）、BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、BEH C8色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）和HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）的分離效果（圖3）。試驗(yàn)結(jié)果顯示，泛酸在BEH C18、BEH C8色譜柱上的保留較差，易受到樣品中雜質(zhì)的干擾。而在C18色譜柱和HSS T3色譜柱上得到了較好的分離效果，響應(yīng)值高，但C18色譜柱的峰型較差，本試驗(yàn)選用HSS T3柱。

圖3 泛酸在4 種色譜柱上的色譜圖

2.2 流動(dòng)相的選擇

分別采用10 mmol/L甲酸銨（含0.05 %甲酸）、10 mmol/L甲酸銨（含0.1 %甲酸）、10 mmol/L甲酸銨（含0.5 %甲酸）和甲醇、乙腈作為流動(dòng)相，以不同流速和梯度進(jìn)行洗脫（圖4）。結(jié)果表明，選用10 mmol/L甲酸銨（含0.5 %甲酸）和甲醇梯度洗脫，泛酸分離效果和響應(yīng)較好。

圖4 泛酸在4種流動(dòng)相中的色譜圖

2.3 基質(zhì)干擾的評(píng)估

鑒于很難在現(xiàn)有樣品中找到泛酸陰性的基質(zhì)，本試驗(yàn)選擇市售羊奶粉、特殊醫(yī)學(xué)配方奶粉（含水解蛋白）、普通牛奶粉作為基質(zhì)干擾的評(píng)估樣品：對(duì)上述3 種基質(zhì)奶粉分別稀釋0 倍、1 倍、2 倍、5倍、10 倍、20 倍，再加入相同濃度的同位素內(nèi)標(biāo)，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖5。圖中依據(jù)稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，內(nèi)標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)繪制了曲線，同時(shí)與水溶內(nèi)標(biāo)液的峰面積作比對(duì)。

圖5 基質(zhì)干擾圖

以水溶液作為基質(zhì)參考，羊奶粉與普通奶粉基質(zhì)干擾明顯較低，而特殊醫(yī)學(xué)配方奶粉有明顯增益作用。在1~20 倍稀釋后趨近平穩(wěn)。由此可見(jiàn)，特殊醫(yī)學(xué)配方奶粉樣液基質(zhì)干擾嚴(yán)重，在試樣中加入用同位素內(nèi)標(biāo)可有效排除基質(zhì)干擾所導(dǎo)致對(duì)結(jié)果的影響。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

準(zhǔn)確吸取泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別添加泛酸同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋成50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、400 ng/mL、600 ng/mL、800 ng/mL、120 0 ng/mL的泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，以鋒面積比（A1泛酸/A2同位素）和同位素質(zhì)量濃度的乘積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，泛酸在5.0～120.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=1.407 48X＋0.002 840 6，相關(guān)系數(shù)（R2）=0.999 96。根據(jù)離子信噪比（RSN）確定檢出限（RSN≥3）為0.423 ng/mL，定量限（RSN≥10）為1.41 ng/mL。當(dāng)取樣量為5 g，檢出限和定量限分別為0.004 23 mg/100 g和0.014 1 mg/100 g。低于國(guó)標(biāo)方法的檢出限（0.025 mg/100 g）和定量限（0.08 mg/100 g）。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取3 種不同基質(zhì)的奶粉樣品，分別進(jìn)行3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)添加水平的回收率試驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定3次，分別計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 泛酸加標(biāo)回收測(cè)試結(jié)果

泛酸3 個(gè)水平的加標(biāo)回收率在90.3%～104.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.42%～2.80%，能夠滿足檢測(cè)實(shí)際樣品需要。

2.6 方法穩(wěn)定性

分別取特殊醫(yī)學(xué)配方奶粉（含水解蛋白）、普通牛奶粉樣品，按照1.3的方法，分別做11 個(gè)平行，考察方法的精密度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 泛酸方法精密度

由表3計(jì)算出11 個(gè)特殊醫(yī)學(xué)配方奶粉（含水解蛋白）樣品平均含量為6.49 mg/100g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.28%；11 個(gè)普通牛奶粉樣品平均含量為4.62 mg/100g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.06 %。

2.7 與《GB 5009.210—2016食品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中泛酸的測(cè)定》第二法的結(jié)果比對(duì)

用《GB 5009.210—2016食品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測(cè)定》第二法液相色譜法和單四級(jí)桿質(zhì)譜法同時(shí)對(duì)羊奶粉、特殊醫(yī)學(xué)配方奶粉（含水解蛋白）、牛奶粉樣品做比對(duì)試驗(yàn)（表4）。

表4 與《GB 5009.210—2016食品中泛酸的測(cè)定》第二法結(jié)果比對(duì)（n=3）

經(jīng)試驗(yàn)，單四級(jí)桿質(zhì)譜法檢測(cè)羊奶粉與牛奶粉的泛酸含量與國(guó)標(biāo)中《GB 5009.210—2016 食品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中泛酸的測(cè)定》第二法 液相色譜法的檢測(cè)結(jié)果差異不明顯。從圖6中可看出，《GB 5009.210—2016 食品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測(cè)定》第二法 液相色譜法測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)配方奶粉時(shí)受雜峰干擾嚴(yán)重，雜峰無(wú)法與目標(biāo)峰分開(kāi)甚至與目標(biāo)峰重合，且結(jié)果不穩(wěn)定，平行性差。而單四級(jí)桿質(zhì)譜法成功解決雜質(zhì)的干擾，其結(jié)果與商品包裝的明示含量一致。

圖6 樣品中泛酸色譜圖

3 結(jié)論

本文建立了液相色譜-單四級(jí)桿測(cè)定嬰幼兒食品中泛酸的方法，相對(duì)于高效液相色譜法，本法有效地排除了水解蛋白對(duì)泛酸定量檢測(cè)中對(duì)目標(biāo)峰的干擾。完全可滿足現(xiàn)有各類配方食品（包括特殊醫(yī)學(xué)配方奶粉、羊奶粉等不同基質(zhì)）中泛酸含量的檢測(cè)；方法具有靈敏度，穩(wěn)定性好操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。由于樣品處理簡(jiǎn)單，分離時(shí)間短，大大地縮短了整個(gè)測(cè)試時(shí)間，提高了工作效率；液相色譜-單四級(jí)桿儀比液相色譜-三重四級(jí)桿儀，具有儀器價(jià)格便宜，分析操作簡(jiǎn)單，更利于在企業(yè)（基層）試驗(yàn)室推廣應(yīng)用。但該儀器采用單離子采集方式，較三重四級(jí)桿靈敏度低，故本方法不能滿足天然食品中低含量泛酸的測(cè)定。該方法在選定的色譜條件下，對(duì)泛酸分離效果好，方法重現(xiàn)性好、回收率高，可作為特殊醫(yī)學(xué)配方食品、嬰幼兒食品中泛酸含量檢測(cè)的優(yōu)選方法。